【摘要】： 慢傳輸性便秘(slow transit constipation, STC)是以結(jié)腸運動功能減弱為特征的一類功能性頑固性便秘,發(fā)病機制不清,保守治療對STC效果有限,嚴重者最終只有手術(shù)切除全(次全)結(jié)腸。大量的臨床資料表明STC多發(fā)于育齡期婦女,男女發(fā)病比例為1:9,女性STC患者往往癥狀更嚴重也更需要手術(shù)治療。一些因素如盆腔手術(shù),分娩,中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等可能是部分女性便秘患者的病因,但也并不能完全解釋STC在女性高發(fā)病率這一現(xiàn)象。近來女性激素異常被認為可能是女性STC發(fā)病的關(guān)鍵,人們觀察到妊娠對人全消化道動力有顯著影響,同時便秘也是妊娠主要的并發(fā)癥之一;女性月經(jīng)周期中黃體期的結(jié)腸傳輸時間較卵泡期顯著延長。進一步研究也證實慢傳輸型便秘患者體內(nèi)過度表達孕酮受體來調(diào)節(jié)收縮性G蛋白,上調(diào)抑制性G蛋白最終導(dǎo)致結(jié)腸動力障礙。雌激素及其受體是否也與結(jié)腸動力障礙有關(guān),其機制如何,迄今國內(nèi)外尚未見報道。 Cajal間質(zhì)細胞(interstitialcells of Cajal, ICC)是腸神經(jīng)系統(tǒng)的一種具有獨立功能的特殊類型的細胞,以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于胃腸道。目前的研究認為ICC主要有3個主要功能:胃腸道平滑肌活動的起搏;推進電活動的傳播;傳遞并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)。一氧化氮(Nitric oxide, NO)是胃腸道的非腎上腺能非膽堿能神經(jīng)引起松弛反應(yīng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),研究證明ICC表達一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)可以產(chǎn)生NO并在調(diào)節(jié)NO依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)方面起重要的作用,其機制推測為:①神經(jīng)沖動傳至ICC后可促其產(chǎn)生NO,作用于平滑肌細胞,產(chǎn)生松弛效應(yīng);②ICC內(nèi)NOS產(chǎn)生NO后,使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加,將抑制性神經(jīng)信號放大;③神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)作用于ICC,控制NO產(chǎn)生,從而控制神經(jīng)信號輸入。 雌激素介導(dǎo)信號快速傳導(dǎo)的作用,可能是通過膜上的蛋白質(zhì)快速激活細胞內(nèi)的第二信號系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),雌激素的刺激會引起磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K),促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)等家族蛋白激酶快速而短暫的活化,雌激素的這種快速作用有以下特點:①作用迅速而短暫,只需幾秒或幾分鐘;②雌激素與不易透過細胞膜的高分子物質(zhì)(如牛血清蛋白)偶聯(lián)后,基本上不能透過細胞膜,但仍能發(fā)揮快速作用;③快速作用不被mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的抑制劑所阻斷;④雌激素快速作用在缺乏雌激素受體(Estrogen receptor, ER)的細胞中仍存在。我們推測雌激素通過非基因組作用快速活化ICC內(nèi)第二信號從而調(diào)控NOS活性進而影響腸道動力。這可能為女性慢傳輸便秘患者的病因研究提供新的見解。 目的: 1.檢測并鑒定ICC細胞膜雌激素作用位點。 2.檢測雌激素通過細胞膜受體以非基因組作用快速激活細胞內(nèi)信號通路。 3.檢測雌激素對ICC細胞NO合成和NOS活性的調(diào)控以及參與調(diào)控的相關(guān)細胞內(nèi)第二信號分子。 方法: 本課題利用原代培養(yǎng)小鼠ICC,在常規(guī)光鏡檢查的基礎(chǔ)上,采用免疫熒光方法對原代培養(yǎng)的ICC進行鑒定;進一步采用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析ICC細胞膜雌激素結(jié)合位點;采用密度梯度離心法分離ICC細胞膜,采用同位素法、放射性配體結(jié)合分析法對mER的平衡解離常數(shù)和最大結(jié)合容量進行分析;對原代培養(yǎng)的ICC采用雌激素刺激,采用免疫沉淀、Western blot法檢測雌激素作用后ICC內(nèi)第二信號分子以及ICC內(nèi)NOS的活化情況,運用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察雌激素快速調(diào)節(jié)ICC的NO合成情況。運用雌激素信號通路各信號分子特異性阻斷劑,了解參與雌激素快速基因組作用的信號傳導(dǎo)途徑。 結(jié)果: 1.免疫組化結(jié)果證實體外成功分離培養(yǎng)小鼠腸道ICC。 2.激光共聚焦觀察顯示,ICC細胞膜上存在雌激素作用位點,當細胞經(jīng)過常規(guī)透膜及固定處理后,ICC細胞核并未發(fā)現(xiàn)雌激素作用位點,說明經(jīng)典的雌激素受體在ICC上并無表達。 3.對提取ICC細胞膜的Na+-K+-ATP酶的活性進行了檢測,結(jié)果表明:提取細胞膜組分的Na+-K+-ATP酶活性為10.23±1.54μmolpi/mg/h而提取細胞漿組分的Na+-K+-ATP酶活性為0.72±0.31μmolpi/mg/h,說明提取細胞膜成功。 4.放射性配體結(jié)合分析及Scathard分析證實ICC細胞膜雌激素受體的的受體最大容量(Bmax)為45.75fmol/mg protein,平衡解離常數(shù)(KD)為0.7173 nmol/L。 5. Western blot實驗結(jié)果顯示:E2和E2BSA能夠在5分鐘內(nèi)快速誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化,磷酸化ERK1/2表達水平在E2作用ICC15分鐘后達到最高,然后快速降低。雌激素受體特異性抑制劑ICI182,780可以阻斷E2快速誘導(dǎo)ERK1/2快速磷酸化的作用 6. Western blot實驗結(jié)果顯示:ICC表達神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal Nitric oxide synthase, nNOS),E2短時間內(nèi)并不能改變nNOS的表達水平。 7. NOS活力檢測結(jié)果顯示:E2和E2BSA快速增高ICC內(nèi)nNOS活性,ICC內(nèi)nNOS活性在E2作用ICC15分鐘后達到最高,然后快速降低。雌激素受體特異性抑制劑ICI182,780和ERK1/2特異性抑制劑UO126均可以阻斷E2快速增高ICC內(nèi)NOS活性的作用。 8.免疫熒光觀測ICC內(nèi)NO合成的結(jié)果和NOS活力檢測結(jié)果一致,E2和E2BSA均可以快速增加ICC內(nèi)NO合成量。這種快速效應(yīng)同樣可以被ICI182,780和UO126阻斷。 結(jié)論: 1.激光共聚焦觀察顯示,ICC細胞膜上存在雌激素作用位點,當細胞經(jīng)過常規(guī)透膜及固定處理后,ICC細胞核并未發(fā)現(xiàn)雌激素作用位點,說明經(jīng)典的核雌激素受體在ICC上并無表達。我們進一步采用放射性配體結(jié)合分析及Scathard分析了ICC細胞膜雌激素受體的的受體性質(zhì)。 2. Western blot實驗結(jié)果顯示E2和E2BSA能夠快速誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化,應(yīng)用雌激素抑制劑ICI182,780可以阻斷這一快速作用。這從功能水平證明了mER的存在。。雌激素可能通過活化ICC內(nèi)ERK1/2蛋白激酶進而影響ICC的功能,發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。 3. NOS活力檢測和NO熒光檢測均證實:mER可以介導(dǎo)E2快速增高ICC內(nèi)nNOS活性進而提高NO產(chǎn)量。應(yīng)用ICI182,780和ERK1/2特異性抑制劑UO126均可以阻斷這一作用,證明E2很有可能是通過mER活化ICC內(nèi)ERK1/2信號通路,進而促進ICC內(nèi)nNOS活化,最后增加ICC內(nèi)NO產(chǎn)量。
【圖文】：

出相應(yīng)的3H-E2 體積的 T 管總結(jié)合。catchard 軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理和分析，特異結(jié)合(Specific Bootal Bound, TB)減去非特異結(jié)合(Nonspecific Bound, NB)得出�？偨Y(jié)合(Total)計數(shù)減去 TB 的計數(shù)，并換算成 fmol 數(shù)。飽和曲度(nmo1)為橫坐標，，SB(fmol/mg protein)為縱坐標；Scatcha標，SB/F 為縱坐標。學(xué)處理和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，以P<0.05 表示結(jié) 果培養(yǎng)小鼠小腸 ICC 及觀察小鼠小腸 ICC 24h 后，倒置顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn) ICC 貼壁，細胞，有少量突起(圖 1-1)。

圖 1-2 小鼠小腸 ICC 體外培養(yǎng) 4d 的形態(tài)(300×)疫組織化學(xué)鑒定養(yǎng) 8d 后，免疫組化 DAB 顯色后光鏡下觀察。c-kit 染色陽性證腸道 ICC�？梢钥吹� c-kit 染色主要位于細胞的胞體部分，細胞)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R574.62

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 朱瑞清;黃酮類化合物的雌激素樣活性及其構(gòu)效關(guān)系研究[D];蘭州理工大學(xué);2012年

本文編號：2609626