【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長約19-24nt的非編碼內(nèi)源性小分子RNA,在生物進(jìn)化過程中高度保守,miRNA不編碼蛋白,絕大多數(shù)miRNA可以通過與靶基因3,UTR區(qū)互補結(jié)合,抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì),進(jìn)而在細(xì)胞、組織甚至個體水平上影響生物體的生長發(fā)育,并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測,人類基因組內(nèi)存在著上千個miRNA基因,調(diào)控基因組內(nèi)1/3左右基因的表達(dá)。近年來,miRNA分子機制的快速發(fā)展不僅揭示了miRNA的生理功能,而且解釋了多種疾病包括癌癥相關(guān)miRNA的異常表達(dá)模式。 研究發(fā)現(xiàn)健康人血液中存在有上百種miRNA,由于來自疾病組織的miRNA在血液中避開了內(nèi)源核糖核酸酶的活性,具有相當(dāng)?shù)姆�(wěn)定性,而且這些miRNA在血液中的含量足夠多,很有可能會在疾病的臨床診斷中發(fā)揮重要作用。miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生及發(fā)展的每一步過程,因此miRNA在腫瘤的早期診斷、預(yù)警及治療等方面均有良好的應(yīng)用前景。本研究主要是為了尋求肝病血漿中異常表達(dá)的miRNA,利用本實驗室建立的poly(A)加尾實時定量RT-PCR技術(shù)定量檢測健康血漿及肝病患者血漿中相關(guān)miRNA的表達(dá)情況,目的是要比較肝病患者血漿與健康人血漿中相關(guān)miRNA的差異。 本研究首先完善了TRI Reagent法提取血漿miRNA的實驗流程,確定了本實驗條件下合適的血漿用量以及血漿與TRI Reagent試劑比例。其次,定量檢測了miR-21、miR-221、miR-224在健康人血漿及肝病患者血漿中的表達(dá)水平。再次,已有研究證實肝癌血漿中存在甲胎蛋白(AFP)mRNA、丙酮酸激酶(PKM2)mRNA和白蛋白(ALB) mRNA,所以本研究中同時關(guān)注了其在健康人血漿及乙肝肝硬化患者血漿中的表達(dá)情況。 主要研究進(jìn)展如下: 1.完善了血漿miRNA提取實驗流程。確定了血漿與TRI Reagent的比例為1:5時提取效果相對較好,血漿用量大于800μl時提取的總RNA適于血漿中miRNA加尾RT-PCR檢測分析。 2.檢測發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-221及miR-224在肝病患者血漿中的量明顯高于健康人血漿。通過對肝病患者進(jìn)行臨床分型,統(tǒng)計分析表明miR-21、miR-221及miR-224在不同類型肝硬化患者血漿中的量高于健康人。 3.分析臨床檢測指標(biāo)與所檢測的miRNA量之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)所檢測的miR-21、miR-221及miR-224除了與個別的臨床檢測指標(biāo)相關(guān)外,與大多臨床檢測指標(biāo)的相關(guān)性不大。 4.在健康人血漿及乙肝肝硬化患者血漿中檢測了AFP mRNA、PKM2 mRNA和ALB mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)這三種mRNA在健康人血漿和乙肝肝硬化患者血漿中均存在差異性表達(dá)。 5.分析檢測的mRNA與臨床檢測指標(biāo)間的相關(guān)性,通過非參數(shù)檢驗證實所檢測AFP mRNA和PKM2 mRNA與臨床檢測指標(biāo)間的相關(guān)性不大,而ALB mRNA與γ-谷氨�；D(zhuǎn)移酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)間具有相關(guān)性。 總之,本研究采用實時定量PCR技術(shù)檢測了肝病患者血漿中相關(guān)miRNA及mRNA的表達(dá)情況,重點關(guān)注了肝硬化患者血漿中相關(guān)miRNA和mRNA的表達(dá)水平變化,這為深入研究肝癌發(fā)生過程中血漿相關(guān)miRNA和mRNA的變化提供了依據(jù)。通過更加深入的大樣本和長期隨訪研究將有可能發(fā)現(xiàn)肝癌早期預(yù)警的微RNA分子標(biāo)志物。該項研究將有助于人們加深對肝臟疾病的了解。
【圖文】：

圖1 miRNA在細(xì)胞中的生成過程及作用方式[3]清 miRNA環(huán) miRNA 與腫瘤形成的相關(guān)性已成為研究的熱由于不易被 RNase 降解，具備良好的穩(wěn)定性，因本文主要總結(jié)了血漿 miRNA 的異常表達(dá)與腫瘤[4]報道稱循環(huán)miRNA作為癌癥診斷的生物標(biāo)志[5]和Gilad 等[6]的相關(guān)研究證實miRNA的這種潛其中有些miRNA的異常表達(dá)僅與某種特定腫瘤的異常表達(dá)可能與兩種以上腫瘤的發(fā)生存在1、miR-17-92及l(fā)et-7似乎在跨組織的腫瘤發(fā)生中標(biāo)志物的特異性及簡便性比較顯著，這證明基會帶來生物標(biāo)志物領(lǐng)域的新變革。的血清miRNA生物標(biāo)志物是miR-21，Charles 等

男4 31 16 3 0性別女 3 8 0 2 5平均值±標(biāo)準(zhǔn)差58±14 50±10 48±8 54±18 49±18年齡平均值(范圍)58（ 40-81）50（31-71）48（37-68）54（35-72）49（25-70）3. 實時定量 PCR 檢測健康人血漿與肝病患者血漿中 miRNA 的表達(dá)在循環(huán)外體 miRNA 的研究中，已有大量文獻(xiàn)證實 miR-21 與多種癌癥（胃癌[11]、胰腺癌[12-15]、卵巢癌[14]、B 細(xì)胞性淋巴瘤[16]等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)而且 Lawrie 等[16]研究稱 miR-21 很可能是彌散性大 B 細(xì)胞性淋巴瘤的臨床診斷標(biāo)志物，，所以在研究中檢測了 miR-21 在健康人血漿及肝病患者血漿中的表達(dá)，結(jié)果證實 miR-21 在肝病患者血漿中的表達(dá)與健康人血漿中的表達(dá)存在差異，提示 miRNA 可能與肝病的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。見圖 2.1。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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1 王曉燕;魏金文;曹亮;蔣曉猛;王銀環(huán);張尤歷;;血清前白蛋白與凝血指標(biāo)聯(lián)合檢測對肝硬化Child-pugh分級的臨床意義[J];山東醫(yī)藥;2007年28期

2 黃金明;葉進(jìn);陳立波;;MicroRNA與HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2008年06期

3 鞠錦斌,陳愛萍;重型肝炎甲胎蛋白的變化及臨床意義[J];醫(yī)學(xué)理論與實踐;2005年01期

4 ;Detection of blood AFPmRNA in nude mice bearing human HCC using nested RT-PCR and its significance[J];World Journal of Gastroenterology;1998年03期

本文編號：2608252