【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis)是與慢性肝臟損傷有關的修復反應過程,是各種慢性肝病進展至肝硬化的中間過程和必經(jīng)階段,其最重要的特征是含有豐富I型膠原蛋白的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成增多,降解減少,這種失衡導致膠原在肝臟組織中過度沉積,部分患者最終發(fā)展為肝硬化(liver cirrhosis)、肝癌。目前認為,早期肝纖維化是一可逆的病理過程,然而,肝硬化作為肝纖維化的終末階段是不可逆轉(zhuǎn)的,因此,如何有效的調(diào)控肝纖維化的進展,抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程,是肝纖維化治療的關鍵。研究發(fā)現(xiàn),活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纖維化發(fā)生的始動細胞,是產(chǎn)生ECM的主要細胞來源。HSC持續(xù)激活后,其增殖、遷移能力明顯增強,并可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,成為肌成纖維樣細胞(myofibroblast),進而分泌各種細胞因子、趨化因子、ECM等,這些分泌的信號分子可進一步促進HSC細胞的激活,該過程是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心環(huán)節(jié),是肝纖維化發(fā)生的決定因素。大量研究證實多種細胞信號分子和途徑介導HSC纖維化特性的調(diào)節(jié),其傳導通路極為復雜,并可與多種細胞因子等外部因素共同作用,在慢性肝損傷進展至肝纖維化的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。然而,其具體的作用機制尚未完全闡明。因此,目前仍需對肝纖維化時HSC持續(xù)活化的信號傳導通路進行深入研究,以進一步探討肝纖維化發(fā)生及HSC持續(xù)活化的分子機制,為肝纖維化防治提供更多有效的干預措施及治療靶點。近年來,P 物質(zhì)(substance P,SP)及其受體(NK-1 receptor,NK-1R)介導的神經(jīng)源性炎癥越來越受到重視,SP與其受體結(jié)合后,通過激發(fā)免疫細胞浸潤和細胞因子釋放的瀑布式級聯(lián)反應在疼痛、肝炎、心肌炎、膽汁淤積、菌血癥、病毒感染等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。此外,SP及其受體同樣參與了血管的形成、腫瘤細胞的增殖、遷移及影響抗凋亡效應。研究表明,阻斷肝臟傳入神經(jīng)或SP受體,可有效降低肝臟損傷的炎癥反應,如水腫的形成、粒細胞的浸潤、以及抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-γ)的生成,同時,可促進肝細胞保護因子如白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)的合成而抑制肝細胞凋亡、壞死而發(fā)揮肝細胞保護作用。由于SP受體阻斷劑不僅可以抑制各種炎癥因子的釋放,還同時具有抗肝細胞凋亡的作用,因此,SP受體阻斷劑很有希望成為抑制肝纖維化的潛在藥物。我們前期試驗研究發(fā)現(xiàn):SP可促進肝臟庫普弗細胞(Kupffercells,KCs)表達NK-1R受體,同時促進腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的釋放而在小鼠免疫性肝損傷中發(fā)揮重要作用。然而,SP是否參與了肝纖維化,尤其是否與HSC激活及持續(xù)活化有關,至今仍不清楚。鑒于此,本實驗研究了 SP對肝星狀細胞活化、增殖及對肝纖維化的影響,并初步探討其內(nèi)在作用機制。第一部分:SP對大鼠肝星狀細胞HSC-T6細胞增殖、活化及凋亡的影響目的:檢測系列濃度的SP在不同的處理時間下對大鼠HSC-T6細胞增殖的影響,同時利用油紅染色檢測系列濃度SP對HSC-T6細胞活化的影響以篩選出SP最佳作用濃度。在此基礎上,應用NK-1R受體阻滯劑(L732138)共處理細胞,并檢測SP/NK-1R受體阻滯劑對HSC-T6細胞凋亡的影響,并行western-blot檢測HSC-T6細胞活化相關蛋白表達變化,以評估SP/NK-1R受體阻滯劑對肝星狀細胞增殖、活化及凋亡的影響。方法:1.使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HSC-T6細胞,應用系列濃度的 SP(10、50、100、500、1000、5000 nM)分別作用 HSC-T6 細胞 6/12 h,行MTT/LDH檢測細胞活性。2.系列濃度的 SP(10、50、100、500、1000、5000 nM)處理 HSC-T6 細胞,行油紅染色、western-blot檢測HSC活化蛋白α-SMA/Collagen Ⅰ表達變化。3.應用NK-1R受體阻滯劑L732138與SP共培養(yǎng)HSC-T6細胞,行MTT/LDH檢測細胞活性,油紅染色,western-blot檢測α-SMA/CollagenⅠ蛋白水平,評估對HSC-T6活化的影響。4.Hoechst33342/PI雙染,流式細胞術(shù)檢測SP及L732138對HSC-T6細胞凋亡的影響。結(jié)果:1.系列濃度的SP(10-5000 nM)處理細胞6 h,MTT/LDH檢測顯示各濃度組無明顯差異。12h時,500/1000nMSP均可明顯升高MTT值并降低LDH的釋放。2.油紅染色顯示500/1000 nMSP可明顯促進HSC-T6細胞脫脂滴,western-blot檢測示 500/1000 nM SP 促進 α-SMA/Collagen Ⅰ 蛋白表達。3.NK-1R阻滯劑L732138可顯著抑制SP對HSC-T6細胞增殖的促進作用,并抑制SP引起的HSC-T6脫脂滴,及α-SMA/Collagen Ⅰ蛋白表達的上調(diào)。4.凋亡相關檢測顯示,500/1000nMSP抑制HSC-T6細胞的凋亡,該作用可被NK-1R受體阻滯劑L732138阻滯。結(jié)論:1.較低濃度(10-100nM)的SP在較短作用時間內(nèi)(6h)對HSC-T6細胞活性無明顯影響,500/1000 nM SP作用HSC-T6細胞12 h,可明顯促進HSC-T6細胞活性,抑制凋亡并促進HSC-T6細胞活化。2.NK-1R受體阻滯劑L732138可抑制SP對HSC-T6細胞活性、增殖及活化的促進作用,并促進HSC-T6細胞的凋亡,表明在體外實驗中,L732138至少可部分抑制SP對肝纖維化的促進作用。第二部分SP在CCl4誘導大鼠肝纖維化模型中的作用目的:應用CC14建立大鼠肝纖維化模型,并同時給予SP受體(NK-1R)阻滯劑L732138 治療,行 HE/Masson/天狼猩紅染色及 western-blot 檢測 α-SMA/Collagen I評估SP及L732138對肝纖維化影響,并檢測大鼠血清學指標以評估SP及L732138對大鼠肝功能的影響。方法:1.建立CC14大鼠肝纖維化模型:6周齡成年雄性Wistar大鼠(體重:180-220g),于每周二、周五給予50%CCl4橄欖油混合液(1ml/kg)腹腔注射,共6周,每周兩次,建立CCl4大鼠肝纖維化模型。2.實驗動物分組及藥物處理:實驗動物共分3批次進行,每批次使用18只Wistar大鼠。18只Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為三組,每組6只,即正常生理鹽水對照組,CC14模型組,CCl4+L732138藥物干預組。模型組大鼠處理方式如上。正常生理鹽水處理組:給予相同劑量的生理鹽水-橄欖油混合液(按照1:1比例混合均勻后使用)。藥物干預組于CCl4造模處理前一天(即每周一、周四)給予L732138右下腹腔注射(0.5 mg/kg),共6周,每周兩次。于末次給藥后24h,將全部大鼠利用10%水合氯醛麻醉,心臟取血并處死,并迅速取出大鼠肝組織,行4%多聚甲醛固定,部分新鮮肝組織-80℃冰箱保存。3.肝組織免疫組織化學染色:測定CCl4模型組SP及NK-1R表達變化。取新鮮肝組織,常規(guī)石蠟包埋,切片,抗原修復后,1%BSA封閉,兔抗SP/NK-1R一抗過夜,熒光二抗室溫2 h行熒光顯色,常規(guī)DAPI染液染核,熒光顯微鏡下觀察拍照。4.Wistar大鼠肝臟組織學染色:取4%多聚甲醛固定的肝組織,石蠟包埋。常規(guī)5 μm厚石蠟切片,行蘇木素伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肝組織纖維化程度及炎癥浸潤程度。Masson及天狼猩紅染色進一步觀察不同處理組膠原沉積情況。5.Western-blot檢測肝纖維化相關蛋白α-SMA/Collagen I表達水平,評估各組肝纖維程度。6.測定肝組織羥脯氨酸含量:取新鮮的4%多聚甲醛固定的肝組織,勻漿器研磨,6 N鹽酸水解過夜后,10 N濃NaOH中和,分別經(jīng)枸櫞酸、氯胺T及過氯酸處理后,最后加入ehrlich試劑65℃處理20 min,酶標儀測定570 nm處吸光度值,根據(jù)羥脯氨酸標準品繪制標準曲線,據(jù)此計算出各檢測樣本的羥脯氨酸的含量,進一步評估各處理組肝纖維程度。7.血清生化檢測:測定各組大鼠血清ALT/AST水平。取各組大鼠新鮮血漿,離心后收集上清,根據(jù)ALT/AST檢測試劑盒說明,檢測各實驗組ALT/AST水平,以評估各組大鼠肝損傷程度。結(jié)果:1.免疫組織化學染色結(jié)果顯示,與對照組相比,CCl4肝纖維化模型鼠肝組織SP及NK-1R表達明顯升高。2.HE染色結(jié)果顯示,正常對照組大鼠肝臟無明顯的病理變化。CCl4模型組大鼠可見肝臟發(fā)生大量的空泡樣變,部分肝細胞壞死;另有大量的炎性細胞浸潤及纖維間隔形成。L732138可在一定程度上抑制CCl4介導的肝纖維樣變,該組大鼠肝組織炎性浸潤細胞減少,纖維間隔同樣較少。Masson/天狼猩紅染色顯示,模型組大鼠可見大量的纖維間隔形成,L732138可減輕模型組肝纖維化程度。3.Western-blot檢測結(jié).果顯示,CCl4模型組大鼠肝纖維化相關蛋白α-SMA/CollagenⅠ表達水平較正常對照組明顯升高;與模型組相比,L732138干預處理后可顯著降低肝組織a-SMA/Collagen I蛋白表達水平,但仍高于正常對照組。4.肝組織羥脯氨酸檢測結(jié)果顯示,模型組羥脯氨酸含量較正常對照組明顯升高,而L732138治療組較模型組明顯降低,但仍高于正常對照組。5.血清生化學檢測顯示模型組ALT/AST顯著升高,L732138可在一定程度降低二者水平。結(jié)論:1.CCl4大鼠肝纖維化模型中,肝組織SP及NK-1R蛋白表達水平明顯升高。2.NK-1R受體阻滯劑L732138可在一定程度上減輕肝損傷,降低肝纖維化程度,發(fā)揮抗肝纖維化作用。第三部分SP影響肝星狀細胞增殖/活化及肝纖維化的機制研究目的:初步探討SP影響HSC活化及肝纖維化的內(nèi)在機制,為肝纖維化的治療提供理論基礎。方法:1.為排除細胞種屬對實驗結(jié)果的影響,本實驗同時在大鼠肝星狀細胞系HSC-T6及人肝星狀細胞系LX2中進行,不同藥物處理后,提取細胞總蛋白行western-blot檢測,觀察SP及NK-1R受體阻滯劑對肝纖維化密切相關信號通路TGFβ1/Smad-3蛋白表達的影響。2.為進一步驗證SP影響肝星狀細胞活化及肝纖維化是否通過TGFβ1/Smad-3信號通路,我們應用TGFβ1受體抑制劑SB431542處理細胞,并行MTT/LDH檢測細胞活性,油紅染色檢測細胞活化情況,western-blot檢測肝纖維化相關蛋白α-SMA/Collagen I表達水平。3.為排除單一藥物本身對肝星狀細胞活化及肝纖維化的影響,我們利用另一種NK-1R受體阻滯劑RP67580處理細胞,MTT/LDH檢測其對細胞增殖,western-blot檢測其對肝纖維化相關蛋白α-SMA/Collagen I的影響。4.動物模型中檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白Caspase-12表達變化。結(jié)果:1.Western-blot結(jié)果顯示,500 nM及1000 nM SP可明顯促進HSC-T6細胞及LX2細胞中TGF-β1,p-Smad-3蛋白表達;NK-1R受體抑制劑L732138可顯著抑制兩種細胞系中SP對TGFβ1/Smad-3信號通路的上調(diào)作用。2.油紅染色結(jié)果顯示,與1000 nM SP組相比,應用TGFβ1抑制劑SB431542處理細胞可明顯抑制HSC-T6細胞脫脂滴,即抑制細胞的活化;MTT/LDH檢測結(jié)果表明SB431542可抑制細胞的增殖,并降低肝纖維化相關蛋白α-SMA/CollagenⅠ的表達。但與L732138處理組相比,差異有統(tǒng)計學意義,說明L732138抑制細胞增殖/活化及肝纖維化的機制不完全通過TGFβ1/Srmad-3 信號通路。3.與L732138對肝星狀細胞增殖活化的影響一致,另一種NK-1R受體阻滯劑RP67580同樣可抑制SP對肝星狀細胞增殖活化的促進作用,并抑制肝纖維化相關蛋白α-SMA/CollagenI的表達。4.動物模型中蛋白表達水平檢測結(jié)果顯示,L732138可抑制肝臟Caspase-12蛋白的表達,說明L732138可通過抑制肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來抑制肝纖維化,而不僅僅是通過TGFβ1/Smad-3信號通路。結(jié)論:1.SP通過TGFβ1/Smad-3信號通路促進肝星狀細胞增殖活化及肝纖維化。2.L732138抑制肝星狀細胞增殖/活化及肝纖維化的機制不完全通過TGFβ1/Smad-3 信號通路。3.L732138可通過抑制肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來抑制肝纖維化。
【圖文】：

圖２系列濃度的ＳＰ作用于ＨＳＣ－Ｔ６細胞１２邋ｈ后，油紅染色檢測結(jié)果。Ａ：分別逡逑為正常對照組、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００邋ｎＭ的ＳＰ作用于ＨＳＣ－Ｔ６細胞逡逑油紅染色結(jié)果。Ｂ：統(tǒng)計分析結(jié)果。＊＊代表Ｐ＜０．０１，邋＊代表Ｐ＜０．０５，，邋ＮＳ代表無統(tǒng)逡逑計學差異。標尺＝１００邋（？ａｎ。逡逑？逡逑４４逡逑

圖３系列濃度的ＳＰ作用于ＨＳＣ－Ｔ６細胞１２邋ｈ后，ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測ａ－ＳＭＡ、逡逑Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋丨的表達變化。Ａ：邐ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ邋檢測邋ａ－ＳＭＡ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ、內(nèi)參邋Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑的表達變化。Ｂ邋：邐ａ－ＳＭＡ／ｐ－ａｃｔｉｉｉ蛋白表達變化統(tǒng)計分析結(jié)果。Ｃ邋：逡逑Ｃｏｌｌａｇｅｎｌ／（３－ａｃｔｉｎ蛋白表達變化統(tǒng)計分析結(jié)果。＊＊代表Ｐ＜０．０１，邋＊代表Ｐ＜０．０５，逡逑ＮＳ代表無統(tǒng)計學差異。逡逑４５逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Wen-Ce Zhou;Quan-Bao Zhang;Liang Qiao;;Pathogenesis of liver cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 ;Effect of TGF-β/Smad signaling pathway on lung myofibroblast differentiation[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年03期

本文編號：2607444