【摘要】：慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是一種由遺傳、環(huán)境或其它因素引起的病理性纖維炎癥綜合征,能夠?qū)嵸|(zhì)損傷或應(yīng)激產(chǎn)生持久的病理反應(yīng)。目前CP病因與發(fā)病機制尚無定論。除酗酒和膽管疾病外,臨床上急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的反復(fù)發(fā)作也是導致CP發(fā)病的重要因素。目前,已有研究證明利用復(fù)合抗生素處理造成腸道菌群紊亂,敲減腸道菌群可有效緩解AP的癥狀。此外,與健康人群相比,CP患者的唾液與腸道微生物發(fā)現(xiàn)了顯著變化。但微生物在CP中扮演何種角色還未可知。因此,本論文采用雨蛙素誘導的小鼠CP模型,探討了抗生素處理造成的腸道菌群紊亂對小鼠CP的作用及可能的機制,以期為治療或預(yù)防CP提供理論基礎(chǔ)。將8周齡左右的雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、抗生素對照組、CP模型組和抗生素處理組。在誘導慢性胰腺炎前一周,給予四組小鼠正常飲食的同時,每天給予抗生素對照組和抗生素處理組小鼠額外灌胃含有復(fù)合抗生素的蒸餾水200μL。第8天起,給予模型組和抗生素處理組小鼠腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)四周,建立CP模型,在此期間持續(xù)抗生素處理。最后一劑雨蛙素注射后的第三天將小鼠處死,快速收集小鼠的血液和胰腺等組織樣品。測定胰腺重量;采用蘇木精-伊紅染色觀察胰腺的組織形態(tài)學變化;采用實時定量PCR測定胰腺炎癥因子以及纖維化相關(guān)基因mRNA表達水平;采用蛋白免疫印跡法檢測胰腺中纖維化相關(guān)蛋白、組蛋白去乙�；�(histone deacetylases,HDACs)和激活G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCR)表達情況;采用氣相色譜-質(zhì)譜檢測小鼠結(jié)腸糞便中短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的含量。實驗結(jié)果表明,抗生素處理造成的腸道菌群紊亂能夠加重小鼠CP,具體表現(xiàn)為:小鼠胰腺萎縮程度顯著升高,胰腺炎癥因子水平顯著上升,胰腺纖維化水平顯著提高。同時抗生素處理能夠顯著降低小鼠結(jié)腸糞便中SCFAs水平,并提高胰腺中HDAC1的表達。隨后,將8周齡左右的雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、CP模型組、抗生素處理組和SCFAs處理組。抗生素處理方式與CP造模方法與上述一致,SCFAs處理采取將近結(jié)腸端濃度的乙酸鹽(67.5 mM)、丙酸鹽(25.9 mM)、丁酸鹽(40 mM)溶入小鼠飲用水中,讓其自由攝取。隨后采用上述方法測定小鼠胰腺重量,觀察胰腺形態(tài)學變化及檢測纖維化相關(guān)蛋白的表達情況。實驗結(jié)果表明,抗生素處理造成腸道菌群紊亂后給予小鼠含有近端結(jié)腸濃度SCFAs的飲用水,能夠有效緩解由抗生素處理引起的胰腺萎縮和纖維化,說明抗生素處理擾亂腸道菌群加重CP的原因與SCFAs的降低有關(guān)。綜上,抗生素擾亂腸道菌群后顯著降低了腸道代謝物SCFAs的濃度,進而降低了SCFAs對HDAC1的抑制作用并最終加劇了小鼠CP的病情。本研究首次證實了抗生素處理擾亂腸道菌群后對小鼠CP有損傷作用,為以后研究腸道菌群在疾病中的作用提供新的方向,也為臨床治療CP提供新的思路。
【圖文】：

江南大學碩士學位論文2.2 實驗方法2.2.1 抗生素預(yù)處理和慢性胰腺炎模型建立將 8 周左右的雄性 C57BL/6J 小鼠隨機分為四組，分別為對照組，抗生素對照組，模型組和抗生素處理組，每組 8~10 只小鼠。在誘導 CP 的前一周，給予抗生素處理組小鼠灌胃含有復(fù)合抗生素的蒸餾水 200μL，水中抗生素濃度分別為：萬古霉素 0.5g/L，新霉素 1g/L，甲硝唑 1g/L，氨芐西林 1g/L[89]。其余兩組給予相同體積的蒸餾水。隨后建立 CP 模型。誘導 CP 最常見的方法是通過重復(fù)的腺體病理刺激造成自限性腺泡細胞損傷，本研究選用腹腔注射雨蛙素的方法建立小鼠 CP 模型。給模型組和抗生素處理組小鼠每小時腹腔注射一次雨蛙素（50 μg/kg），連續(xù)注射 6 小時。每周間隔注射 3 天，，連續(xù)注射 4 周。對照組注射等劑量生理鹽水。造模期間每 2 天灌胃一次抗生素。在處死小鼠的前一天下午收集糞便，在最后一次注射雨蛙素后的第 3 天，人道處死小鼠并快速收集血液、胰腺和結(jié)腸等組織，并將其保存在-80℃超低溫冰箱中。

.2.3 胰腺組織形態(tài)學分析采用蘇木精-伊紅染色法觀察組織形態(tài)。堿性的蘇木精能夠?qū)⒓毎酥兴嵝缘暮藶樗{紫色；而酸性的伊紅能夠?qū)A性的細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)染為紅色。操作步驟大下：（1）固定：處死小鼠后將胰腺放入 4%的中性多聚甲醛中固定。根據(jù)組織質(zhì)感確定時間，大致在 12~36 小時。（2）脫水、透明和浸蠟：取出固定液中的組織，流水沖洗表面多余的固定液，依過 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇逐步進行脫水，隨后將樣品依次二甲苯-乙醇（1:1）和二甲苯溶液中進行透明。組織透明結(jié)束后立即放入提前融化點溫度的石蠟中進行浸蠟，時間為 2~3 小時。（3）包埋：將浸蠟處理后的胰腺組織包埋，確保包埋時保持胰腺的最大切面。圖 2-2 SCFAs 處理與 CP 模型示意圖Fig. 2-2 Diagram for SCFAs treatment and CP model
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R576

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本文編號：2607312