【摘要】：[目的] 研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)可以感染多種免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞能否被HBV感染及其感染機(jī)制目前尚不清楚。微顆粒是具有雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊狀小體,多項(xiàng)研究表明其可作為細(xì)胞間傳遞信息和物質(zhì)的載體。本研究從HBV陽性患者外周血中分離微顆粒與巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后,檢測巨噬細(xì)胞HBV顆粒以及不同蛋白的表達(dá),探討微顆粒介導(dǎo)HBV感染巨噬細(xì)胞的可能性。進(jìn)一步探討HBV感染細(xì)胞后對Grp78及MHC-I表達(dá)的調(diào)控作用。 [方法] 1.從HBV陽性患者的外周血中分離微顆粒作為實(shí)驗(yàn)組,來自HBV陰性個(gè)體外周血的微顆粒作為對照組； 2.從兩組中采集一部分微顆粒做熒光染色(PKH-26標(biāo)記微顆粒,FITC標(biāo)記HBV),并使用激光共聚焦顯微鏡觀察微顆粒內(nèi)是否包涵HBV,其余微顆粒與巨噬細(xì)胞(U937細(xì)胞)混合培養(yǎng)8h及24 h； 3.采用PKH-26和CFSE分別對微顆粒和巨噬細(xì)胞染色； 4.采用激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)微顆粒； 5.采用透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV病毒顆粒； 6.采用細(xì)胞免疫組化方法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg表達(dá)；ELISA法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)和上清內(nèi)HBsAg和HBeAg的表達(dá)：采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg和HBx蛋白表達(dá)； 7.采用real-timePCR方法分別檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和HBV-cccDNA水平,同時(shí)檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA水平； 8.分離提取被HBV感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒,與新的巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后采用real-timePCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平。 9.轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)研究HepG2細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、Grp78和MICA/B分子的表達(dá)情況； 10.采用雙光子共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞表面MHC-1分子和Grp78分子的定位情況； 11.通過siGrp78和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以及siHLA和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)研究HepG2細(xì)胞表面MHC-Ⅰ及Grp78分子的表達(dá)； 12.轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒至T2細(xì)胞和H22細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)研究兩種細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、Grp78分子的表達(dá)； 13.將NK細(xì)胞與轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的H22細(xì)胞共同培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)觀察NK細(xì)胞對后者的殺傷效應(yīng)。 [結(jié)果] 1.共聚焦顯微鏡觀察可見來自HBV陽性患者外周血的微顆粒內(nèi)包涵有HBV�；旌吓囵B(yǎng)8h后,可在巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)微顆粒。 2.混合培養(yǎng)24 h后,可通過透射電鏡在HBV陽性組巨噬細(xì)胞內(nèi)觀察到HBV病毒顆粒。 3.混合培養(yǎng)24 h后,經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)HBcAg染色呈陽性,細(xì)胞免疫熒光方法檢測到巨噬細(xì)胞內(nèi)有HBcAg和HBx蛋白表達(dá)；而對照組未觀察到病毒顆粒以及HBcAg及HBx蛋白表達(dá)； 4. ELISA結(jié)果提示HBV陽性組巨噬細(xì)胞通過凍融和裂解兩種方法提取的抗原及培養(yǎng)上清內(nèi)的HBsAg和HBeAg表達(dá)呈陽性,對照組則呈陰性； 5.定量分析結(jié)果顯示,混合培養(yǎng)24 h以后,實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBV-cccDNA水平和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液的HBV DNA水平均明顯高于對照組； 6.分離提取了三代被HBV感染的巨噬細(xì)胞釋放的微顆粒,與未感染的巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)后,結(jié)果提示,連續(xù)四代細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平均呈陽性。 7.轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒后HepG2細(xì)胞MHC-Ⅰ和Grp78表達(dá)升高,MICA/B分子表達(dá)則無明顯變化； 8.雙光子共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞表而MHC-1分子和Grp78分子表現(xiàn)為共定位情況,提示二者以復(fù)合體形式存在于細(xì)胞表面； 9. SiGrp78和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以及siHLA和HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅰ與Grp78分子的表達(dá)具有相關(guān)性。 10.NK細(xì)胞對于轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒的H22細(xì)胞殺傷效率下降。 [結(jié)論] HBV陽性患者外周血的微顆粒包涵有HBV,并可介導(dǎo)感染巨噬細(xì)胞,提示攜帶HBV的微顆�？勺鳛镠BV感染巨噬細(xì)胞的載體,HBV通過微顆粒感染巨噬細(xì)胞后可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,并可通過釋放微顆粒的方式不斷感染更多的巨噬細(xì)胞。HBx可上調(diào)感染細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ類分子Grp78的表達(dá)。MHC-Ⅰ類分子和Grp78的表達(dá)具有相關(guān)性,兩種分子處于共定位狀態(tài),以復(fù)合體形式存在于細(xì)胞膜表面；由于HBx上調(diào)MHC-Ⅰ與Grp78分子的表達(dá),NK細(xì)胞對感染細(xì)胞的胞毒活性受阻。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2607064