發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 02:15

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約20～24 nt的非編碼單鏈小分子RNA,它們通過(guò)與目標(biāo)mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致該mRNA分子的翻譯受到抑制或影響其穩(wěn)定性,從而調(diào)控下游的生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái),除了對(duì)microRNA產(chǎn)生的剪接機(jī)制和下游功能展開(kāi)了深入而廣泛的研究,對(duì)于microRNA初始轉(zhuǎn)錄本生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究也是方興未艾。 人miR-122是我們所關(guān)注的一個(gè)肝臟特異性小RNA。它的初始轉(zhuǎn)錄本來(lái)源于人18號(hào)染色體上hcr基因的轉(zhuǎn)錄,其成熟本在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。miR-122在肝臟發(fā)育過(guò)程中持續(xù)表達(dá),且隨肝臟細(xì)胞的分化成熟表達(dá)增高。研究表明：在病理狀態(tài)下,miR-122促進(jìn)丙型肝炎病毒(HCV)在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,并與肝細(xì)胞肝癌(HCC)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)；在生理狀態(tài)下,miR-122參與肝細(xì)胞表型,肝臟的分化,發(fā)育與代謝,以及肝細(xì)胞應(yīng)急應(yīng)答等基本生命活動(dòng)過(guò)程。miR-122的沉默可導(dǎo)致小鼠血漿膽固醇和甘油三酯水平的顯著降低,說(shuō)明miR-122是肝臟脂肪代謝的重要調(diào)控者。 FOXO1是哺乳動(dòng)物叉頭蛋白家族O亞族四個(gè)成員之一。叉頭蛋白家族中,特別是FOXO1在整個(gè)機(jī)體的能量代謝中起著至關(guān)重要的作用。在饑餓狀態(tài)下,肝臟通過(guò)FOXO1在促進(jìn)糖異生酶類表達(dá)中的關(guān)鍵作用維持血糖的水平。而在進(jìn)食后,胰島素分泌增加,通過(guò)PI3K-Akt途徑磷酸化FOXO1使其出核,部分抑制糖異生酶類在肝臟中的表達(dá)。除了直接調(diào)控代謝,FOXO1還在骨骼肌和脂肪組織這兩大維系能量穩(wěn)態(tài)平衡的主要器官的形成過(guò)程中起重要作用。另外,FOXO1的表達(dá)可促進(jìn)抗氧化應(yīng)激的基因表達(dá),從而起到細(xì)胞保護(hù)功能。FOXO1也能促進(jìn)碳水化合物向脂肪酸的轉(zhuǎn)換,使其在饑餓狀態(tài)下成為主要的能量來(lái)源。 本研究旨在探索糖脂代謝重要因子FOXO1對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其調(diào)控機(jī)制。首先,我們利用UCSC網(wǎng)站和ECR browser等在線分析軟件對(duì)miR-122成熟本上游5kb的片段進(jìn)行生物信息學(xué)的分析,發(fā)現(xiàn)在之前本室鑒定的miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)FOXO1的保守結(jié)合位點(diǎn)。然后利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定克隆兩種辦法將FOXO1的野生型表達(dá)質(zhì)粒FOXO1-WT和有著三個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變的核內(nèi)組成型表達(dá)質(zhì)粒FOXO1-CA及空載體對(duì)照在肝細(xì)胞系Huh7中表達(dá),發(fā)現(xiàn)野生型FOXO1蛋白對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)正調(diào)控模式,而核內(nèi)組成型表達(dá)的FOXO1蛋白對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控模式。接著,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)確定了FOXO1對(duì)miR-122上游啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并利用miR-122上游調(diào)控區(qū)的片段截短和突變實(shí)驗(yàn)來(lái)確定了FOXO1調(diào)控miR-122轉(zhuǎn)錄的具體位點(diǎn)是miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE(胰島素應(yīng)答元件)元件。最后,我們利用鑒定轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)典方法凝膠遷移速率實(shí)驗(yàn)(EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)分別從體外和體內(nèi)進(jìn)一步確定了FOXO1可以直接結(jié)合于miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE位點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)FOXO1的這種結(jié)合在血清剝奪后的低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下增強(qiáng)而在回復(fù)血清后的高營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下減弱,并且它與HNF4對(duì)該IRE位點(diǎn)的結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的。 綜上所述,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)FOXO1可作為miR-122的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)結(jié)合到miR-122核心啟動(dòng)子區(qū)的IRE位點(diǎn)來(lái)調(diào)控miR-122初始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄。這種結(jié)合受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)的信號(hào)通路的影響,同時(shí)也受到HNF4對(duì)該位點(diǎn)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng),可最終參與到肝臟脂代謝的精細(xì)調(diào)控過(guò)程中。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575

【同被引文獻(xiàn)】

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1 范春光;王春梅;王燕;李麗;孫汶生;劉玉剛;李瑞峰;;miR-122表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的抑制作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年10期

2 李蘇娟;陳智;朱海紅;;miR-122對(duì)IFN-α抗HCV效應(yīng)的影響[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 郝美君;miR-122對(duì)HBV調(diào)節(jié)作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：2606875