【摘要】：研究背景和目的炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),它是累及腸道的慢性、炎癥性、毀損性疾病。目前認(rèn)為,遺傳和環(huán)境因素共同作用啟動機體異常免疫是IBD的主要病因之一,但其具體機制尚不明確。新型納米材料氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)在日常社會生產(chǎn)及生活中應(yīng)用廣泛。因此,其長期暴露對腸道炎癥的影響逐漸受到重視。為了更好的了解GO暴露對IBD發(fā)生發(fā)展的影響,本研究在應(yīng)用硫酸葡聚糖鈉(Dextran sulfate sodium,DSS)成功構(gòu)建急性小鼠腸炎模型的基礎(chǔ)上探討了 GO對其腸道炎癥的影響,并且通過體外建立腸上皮細胞(Intestinal epithelial cells,IECs)模型進一步探究了其潛在機制。方法1.GO的理化性質(zhì)和表征:使用原子力顯微鏡(Atomic force microscopy,AFM)、透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)觀察GO表面形態(tài)、原始粒徑以及厚度。利用拉曼光譜(Raman spectroscopy)檢測GO材料內(nèi)部缺陷。另外,使用動態(tài)光散射儀(Dynamic light scanning,DLS)檢測GO在不同溶劑中的穩(wěn)定性和分散性,并用平均粒徑、多分散指數(shù)(Polydipersity index,PDI)和zeta電位來評估。2.動物模型的構(gòu)建和分組:6-8周大小的雌性C57B1/6小鼠飲用2.5%DSS溶液長達5 d成功構(gòu)建急性腸炎模型,后恢復(fù)正常飲用水4 d,動物實驗周期共9d。小鼠分組如下:WT組(無任何處理)、WT-GO組(僅灌胃GO)、DSS-WT組(僅DSS處理)和DSS-GO組(在DSS處理的基礎(chǔ)上灌胃GO),分別在造模第2、4、6、8天分別給小鼠予以5、30以及60 mg/kg劑量的GO溶液灌胃。3.體內(nèi)實驗的觀察指標(biāo):日常記錄小鼠體重及大便性狀,于第9日行頸椎脫臼法處死小鼠。收集結(jié)腸組織進行HE染色觀察腸道炎癥情況、qPCR檢測炎癥因子表達情況以及TUNEL染色觀察腸道凋亡情況。4.腸上皮細胞模型的構(gòu)建:在體外實驗中,選用人正常結(jié)腸黏膜上皮細胞,FHC細胞作為腸上皮細胞模型。5.GO在腸上皮細胞內(nèi)的定位情況:使用TEM及免疫熒光顯微鏡分別觀察GO或FITC-BSA標(biāo)記的GO的攝取和在細胞內(nèi)的分布。6.GO對腸上皮細胞毒性作用的影響:不同濃度GO(0、10、25、50、100和200 μg/mL)處理FHC細胞24 h以及0、25和50μg/mL GO分別處理細胞6、12和24 h,使用毒性增殖實驗(Cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放試劑盒分別檢測細胞活力和細胞上清中LDH含量;選用25和50μg/mLGO處理FHC細胞24h,LPS處理組作為陽性對照組,利用實時熒光定量PCR(quantantive PCR,qPCR)檢測炎癥因子IL-6、IL-10、IL-1β以及TNF-α的表達情況。另外,利用Western blot檢測p65蛋白表達。7.GO對腸上皮細胞線粒體和ROS的影響:分別使用TEM觀察GO處理后FHC細胞線粒體結(jié)構(gòu)以及流式細胞技術(shù)儀檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP);應(yīng)用免疫熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS生成。8.GO對腸上皮細胞凋亡的影響:使用流式細胞技術(shù)儀檢測細胞凋亡數(shù)量。提取蛋白進行Western blot,檢測凋亡相關(guān)蛋白,包括CytC、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3以及AMPK信號通路相關(guān)蛋白的表達;9.GO誘導(dǎo)細胞凋亡機制的研究:使用抗氧化劑N-acetyl-L-cysteine(NAC)清除細胞內(nèi)ROS和AMPK抑制劑Compound C(Com.C)抑制FHC細胞內(nèi)AMPK通路活性后,檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)和信號通路的變化;結(jié)果1.GO的表征和穩(wěn)定性:使用AFM觀察到本研究中所使用的GO為不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu),厚度約為1.0 nm,粒徑主要在200-300 nm之間。使用TEM觀察到的GO結(jié)構(gòu)與AFM結(jié)果基本一致,且GO表面不光滑,邊緣銳利。拉曼光譜結(jié)果顯示GO的D峰和G峰的峰值分別為1835 cm-1和1521 cm-1。根據(jù)DLS結(jié)果得知,GO在雙蒸水、PBS以及RPMI 1640培養(yǎng)基溶液中靜置12 h至5 d時,其主要粒徑均在200-300 nm之間。然而,在靜置長達7 d時GO在不同溶劑中的穩(wěn)定性存在明顯差異。GO在雙蒸水中仍然比較穩(wěn)定,PDI始終保持在1.0。而GO在PBS和RPMI 1640培養(yǎng)基中的PDI分別下降為0.7和0.5。2.GO加重了DSS腸炎小鼠的腸道炎癥:在體內(nèi)使用DSS成功構(gòu)建腸炎小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)予以60 mg/Kg GO溶液灌胃處理可以加重小鼠腸炎,表現(xiàn)為小鼠體重持續(xù)下降、結(jié)腸長度明顯縮短、上皮結(jié)構(gòu)完全破壞以及炎癥細胞嚴(yán)重浸潤。qPCR結(jié)果顯示,與DSS-WT組相比較,DSS-GO組小鼠腸道IL-6和IL-17表達明顯上調(diào),而IL-10表達顯著下調(diào)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn),DSS-GO組小鼠腸道上皮組織內(nèi)發(fā)生了明顯的凋亡。然而,在WT組與GO-WT組小鼠腸道中均未觀察到明顯病理異常。3.GO經(jīng)FHC細胞攝取后誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生明顯的細胞毒性:GO經(jīng)FHC細胞攝取后主要分布細胞胞漿,且GO對FHC細胞活力的抑制作用和對LDH釋放的促進作用均與處理時間、處理濃度呈正相關(guān);另外,GO誘導(dǎo)了炎癥因子IL-1β的釋放。4.GO能誘導(dǎo)線粒體損傷并誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS生成:GO誘導(dǎo)了線粒體損傷,表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)破壞以及MMP明顯下降;同時,胞內(nèi)觀察到明顯的ROS生成。5.GO能誘導(dǎo)FHC細胞凋亡的發(fā)生:相比于對照組,GO處理能誘導(dǎo)更多的FHC細胞發(fā)生凋亡,且伴隨細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白CytC、Bax和cleaved caspase-3表達上調(diào)以及Bcl-2表達下調(diào)。同時,GO能顯著激活FHC細胞內(nèi)的AMPK/p53信號通路。6.GO誘導(dǎo)的FHC細胞凋亡受ROS/AMPK/p53通路調(diào)控:使用NAC清除細胞內(nèi)ROS和Com.C抑制AMPK通路后能明顯減輕GO誘導(dǎo)的細胞凋亡。結(jié)論1.GO可以加重DSS誘導(dǎo)的急性腸炎,但對于無炎癥基礎(chǔ)疾病的正常健康小鼠腸道無明顯損傷。2.GO能夠誘導(dǎo)FHC細胞產(chǎn)生細胞毒性、細胞膜破壞釋放LDH、線粒體損傷、ROS生成以及細胞凋亡。3.GO誘導(dǎo)ROS/AMPK/p53通路激活調(diào)控的腸上皮細胞凋亡可能是其加重小鼠急性腸炎的主要機制。
【圖文】：

第三章結(jié)果逡逑１．邋ＧＯ的表征和理化性質(zhì)逡逑本研宄中所使用的ＧＯ成品，根據(jù)圖１－１邋Ａ所示，ＡＦＭ結(jié)果顯示ＧＯ呈單逡逑層片狀結(jié)構(gòu)，，可見最大粒徑約５００邋ｎｍ，但其主要粒徑分布在２００－３００邋ｎｍ之間。逡逑ＧＯ的厚度約ｌｎｍ，符合ＧＯ作為單層納米結(jié)構(gòu)的基本特征。同時，本研宄使用逡逑ＴＥＭ更為清晰、直觀地表征ＧＯ表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)。如圖１－１邋Ｂ所示，ＴＥＭ下觀逡逑察到的結(jié)果與ＡＦＭ結(jié)果基本一致，且ＧＯ邊緣銳利，表面不光滑。圖１－１邋Ｃ結(jié)逡逑果為ＤＬＳ所測得的ＧＯ原始粒徑分布圖，粒徑在２００－３００邋ｎｍ之間。為了進一步逡逑驗證本實驗中使用的ＧＯ為公認(rèn)的石墨烯衍生物，使用拉曼光譜分析了邋ＧＯ的結(jié)逡逑構(gòu)缺陷和特異性高峰。在圖１－１邋Ｄ中觀察到ＧＯ具有兩個特征性高峰，分別為Ｄ逡逑峰（Ｄ邋ｐｅａｋ）和Ｇ峰（Ｇ邋ｐｅａｋ）。拉曼光譜表征顯示Ｇ邋ｐｅａｋ峰值位于１５２１邋ｃｍ－１

圖２－１－１．小鼠造模示意圖逡逑６－８周大小的雌性Ｃ５７Ｂ１／６小鼠分組如下：ＷＴ組（未做任何處理）、ＷＴ－ＧＯ組（灌胃逡逑ＧＯ）、ＤＳＳ－ＷＴ組（僅給予ＤＳＳ處理）以及ＤＳＳ－Ｇ０組（在ＤＳＳ造模的基礎(chǔ)上給予ＧＯ處逡逑理），每組小鼠共５只。通過２．５％邋ＤＳＳ溶液暴露給小鼠達５邋ｄ后更換正常飲用水４邋ｄ構(gòu)建急逡逑性腸炎模型，于第２、４、６、８天分別灌胃５、３０以及６０邋ｍｇ／ｋｇ的ＧＯ溶液暴露給小鼠。于逡逑第９日處死小鼠，收集結(jié)腸組織備用。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１－１．邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ逡逑６－８邋ｗｅｅｋｓ邋ｏｌｄ邋ｆｅｍａｌｅ邋Ｃ５７Ｂ１／６邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｆｏｕｒ邋ｇｒｏｕｐｓ邋（ｎ＝５，邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ）：邋ＷＴ逡逑ｇｒｏｕｐ邋（ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＤＳＳ邋ｏｒ邋ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），邋ＧＯ－ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｏｎｌｙ邋ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），邋ＤＳＳ－ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｏｎｌｙ逡逑ＤＳＳ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）邋ａｎｄ邋ＤＳＳ－ＧＯ邋ｇｒｏｕｐ邋（ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｅｔｔｉｎｇ邋ｏｆ邋ｃｏｌｉｔｉｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ－ｂｙ邋ＤＳＳ逡逑ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）．邋Ｔｏ邋ｉｎｄｕｃｅ邋ａｎ邋ａｃｕｔｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ邋ｍｏｄｅ，邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｇｉｖｅｎ邋２．５％邋ＤＳＳ邋ｉｎ邋ｄｒｉｎｋｉｎｇ邋ｗａｔｅｒ邋ｆｏｒ邋５逡逑ｄａｙｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ邋ｇｉｖｅｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｄｒｉｎｋｉｎｇ邋ｗａｔｅｒ邋ｆｏｒ邋４邋ｄａｙｓ．邋Ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｏｒａｌｌｙ邋ａｄｉｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ邋ｗ
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R574

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