【摘要】：[研究背景] 非可控性炎癥在腫瘤的啟動、促進(jìn)與進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。結(jié)直腸癌是世界第三大癌,嚴(yán)重威脅人類健康。非可控性的結(jié)腸炎癥,如潰瘍性結(jié)腸炎,可顯著增加罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn),且結(jié)直腸癌的發(fā)生與炎癥的嚴(yán)重程度、范圍等因素呈正相關(guān)。結(jié)腸炎相關(guān)性癌與傳統(tǒng)意義上的結(jié)直腸癌相似,為一涉及多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。而與經(jīng)典結(jié)直腸癌的“腺瘤-腺癌”序列不同,潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展至結(jié)直腸癌經(jīng)歷了“炎癥-不典型增生-癌癥”的序列演進(jìn)。目前對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究才剛剛起步,尚缺乏針對連續(xù)病變階段的動態(tài)組學(xué)研究,對其分子機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知也不全面。為從全基因組轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平兩個(gè)層面全面、深入地探討“炎-癌鏈”中的分子事件及其交互作用網(wǎng)絡(luò),本研究在構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)的非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型基礎(chǔ)上,采用全基因組表達(dá)譜基因芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析、炎癥因子抗體芯片(蛋白芯片)技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR以及免疫組織化學(xué)法,對“炎癥-不典型增生-癌癥”序列演進(jìn)過程的轉(zhuǎn)錄組及“炎-癌”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號通路與分子的動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行分析歸納,旨在為非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制和臨床診治提供理論依據(jù)。 [非可控性結(jié)腸炎及結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的構(gòu)建] 通過單次小劑量地腹腔注射誘變劑氧化偶氮甲烷,1周后予以循環(huán)飲用致炎劑葡聚糖硫酸鈉,我們成功構(gòu)建非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性癌小鼠模型。該模型具有與人類潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性癌相似的特征：(1)臨床表現(xiàn)上均有腹瀉、大便隱血、粘液膿血便、體重不增或下降。(2)病理學(xué)觀察,給予葡聚糖硫酸鈉后小鼠結(jié)直腸出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),大量炎性細(xì)胞浸潤,糜爛與淺潰瘍從大腸遠(yuǎn)端向近端發(fā)展；隨著葡聚糖硫酸鈉的循環(huán)飲用,形成非可控性的慢性腸道炎癥,疾病進(jìn)展呈現(xiàn)典型的“炎癥-不典型增生-腺癌”的序列演進(jìn)過程；不典型增生以扁平型為主,不典型增生與癌呈多灶性,且發(fā)生于炎癥較重的部位。(3)小鼠模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎及結(jié)腸炎相關(guān)性癌有相似的表達(dá)譜特征。以上發(fā)現(xiàn)證實(shí)該模型可較好地模擬人類潰瘍性結(jié)腸炎與炎癥相關(guān)性癌,有科學(xué)應(yīng)用價(jià)值,可為后續(xù)試驗(yàn)提供保障。 [非可控性結(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化規(guī)律] 轉(zhuǎn)錄水平的變化是基因組遺傳信息的集中體現(xiàn),為了全面地揭示潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌病變各階段轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化規(guī)律,本研究選取“正常-炎癥-不典型增生-腺癌”各病理階段的小鼠腸道黏膜進(jìn)行全基因組表達(dá)譜芯片分析。研究發(fā)現(xiàn),各病理階段的基因表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,尤以早期炎癥期的分子變化最為顯著,分別有2245與2294個(gè)基因探針在炎癥組織中較正常組織發(fā)生了上調(diào)與下調(diào),形成一陣“轉(zhuǎn)錄風(fēng)暴”。多種聚類分析顯示炎癥期的樣本嚴(yán)格聚為一類,在主成分中占有絕對地位。對基因注釋本體(GO)的富集度網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),該時(shí)期變化最顯著的為炎癥相關(guān)基因集,包括直接參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、趨化炎癥細(xì)胞的趨化因子、誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附的粘附分子、參與組織修復(fù)的血管生成因子與基質(zhì)重建因子、誘導(dǎo)壞死細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腸上皮細(xì)胞存活與增殖的因子等等,而這些基因集在不典型增生及癌癥期表達(dá)趨于緩和,表明機(jī)體在早期處于積極地防御狀態(tài),而至后期,機(jī)體逐漸對炎癥與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受,轉(zhuǎn)錄水平改變趨緩；也提示腫瘤微環(huán)境對免疫細(xì)胞的改造作用。這種早期的劇變可能已經(jīng)決定了細(xì)胞的命運(yùn)與疾病的走向。在癌癥期,仍有部分炎癥因子的活躍,主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)血管新生與基質(zhì)降解的基因表達(dá)上調(diào),充分體現(xiàn)出結(jié)直腸癌的惡性行為特征。 [信號通路的階段性活化是連接“炎-癌”的紐帶] 經(jīng)基因表達(dá)譜芯片的生物信息學(xué)分析及免疫組化驗(yàn)證,本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CAC進(jìn)程中存在階段性活化。其中NF-κB經(jīng)典途徑(p65)與STAT3兩條信號通路在“炎癥-不典型增生-癌”的序列演進(jìn)中呈現(xiàn)持續(xù)性活化,p65、磷酸化STAT3(p-STAT3)及其靶基因編碼蛋白Bcl-xL、COX-2的表達(dá)均呈逐級升高的趨勢；NF-κB旁路途徑(p52)僅在炎癥細(xì)胞中活化,且在炎癥期最為活躍,而不典型增生期至癌癥期表達(dá)逐漸下調(diào)；p38MAPK信號的活化發(fā)生于炎癥期及不典型增生期；在腫瘤形成階段p38MAPK失活,而Wnt/β-catenin通路開始處于明顯活化狀態(tài)。這些結(jié)果表明,NF-κB經(jīng)典途徑與旁路途徑、STAT3及p38MAPK可能對炎癥的啟動和維持具有重要作用,參與炎癥細(xì)胞的趨化、促炎因子的釋放；而NF-κB經(jīng)典途徑、STAT3及p38MAPK誘導(dǎo)的持續(xù)性炎癥反應(yīng)又對腸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生積極作用,微環(huán)境當(dāng)中的細(xì)胞中上述信號的激活導(dǎo)致細(xì)胞因子的持續(xù)產(chǎn)生,繼續(xù)作用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞,促進(jìn)其存活與生長；隨著Wnt/β-catenin通路的激活與p38MAPK的失活(p38MAPK被認(rèn)為是抑瘤基因),促瘤與抑瘤的平衡終于被打破,在NF-κB經(jīng)典途徑與STAT3信號所營造的炎性背景下,腫瘤穩(wěn)定形成與進(jìn)展。 [非可控性結(jié)腸炎癌變過程動態(tài)交互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)] 結(jié)合表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析及血清炎癥因子芯片的檢測結(jié)果,我們找到非可控性結(jié)腸炎癌變過程各病變階段的交互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。炎癥期,IL-1p、IL-6、COX-2及CEBPB位于上調(diào)的分子網(wǎng)絡(luò)中心,CYP家族成員、緊密連接蛋白o(hù)ccludin與肝細(xì)胞核因子4α位于下調(diào)的分子網(wǎng)絡(luò)中心；不典型增生期,上調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為CD44和VCAM-1,下調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為CYP家族和GSTM家族成員；癌癥期,上調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)包括IL-23a、CXCL2、IL-1β、 LCN2、TIMP1、MMPs、TCF2等,下調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)則由CYP家族與ALDH家族成員組成。這些關(guān)鍵分子與眾多的差異分子發(fā)生交互作用,并與NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等信號通路緊密相聯(lián),形成特色的階段性的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),推動非可控性炎癥介導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化。 綜上所述,利用小鼠模型研究“非可控性結(jié)腸炎-不典型增生-結(jié)直腸癌”序列演進(jìn)過程中不同病理階段轉(zhuǎn)錄組變化規(guī)律,并在蛋白水平進(jìn)行初步驗(yàn)證,為我們進(jìn)一步探索相關(guān)分子機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過高通量的全基因組表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)了基因組的動態(tài)轉(zhuǎn)錄規(guī)律,在炎癥早期形成的轉(zhuǎn)錄風(fēng)暴似乎決定了疾病的走向,通過生物信息學(xué)分析和免疫組化驗(yàn)證,首次報(bào)道了NF-κB、STAT3、p38MAPK及Wnt/β-catenin等關(guān)鍵信號通路的階段性活化規(guī)律；而對血清炎癥因子芯片的篩查則對上述結(jié)論提供了更有力的支撐。這說明在炎-癌演進(jìn)的多階段過程中,關(guān)鍵信號通路及其下游靶基因的階段性活化發(fā)揮主要推動作用。盡管小鼠與人類的同源性很高,對研究結(jié)論的推廣尚需進(jìn)行大量臨床樣本的驗(yàn)證。將人類疾病樣本數(shù)據(jù)與動物模型數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,有望為臨床上對潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的早期診治提供新的思路；并提示醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)高度重視對慢性炎癥的預(yù)防與治療,阻止炎癥的惡性轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 李曉寧;陳姪;;潰瘍性結(jié)直腸炎與結(jié)直腸癌的相關(guān)性[J];中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志;2008年06期

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本文編號：2605843