【摘要】：【背景】隨著肥胖和代謝綜合征(metabolic syndrome,MetS)在全球范圍內(nèi)的流行,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率正在逐年增加,目前已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)危害人類健康的主要慢性肝臟疾病。由于NAFLD的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜,至今尚未闡明,所以目前仍然沒有批準(zhǔn)用于治療NAFLD的藥物。不管是經(jīng)典的“二次打擊”假說還是近來提出的“多重平行打擊”假說都認(rèn)為肝臟脂質(zhì)代謝紊亂引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的大量過度堆積是引起NAFLD的起始核心機(jī)制。因此闡明肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的分子機(jī)制及尋找潛在的NAFLD治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。近年研究發(fā)現(xiàn)蛋白的乙�；�/去乙酰修飾在肝臟的能量代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面扮演了重要的角色。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是目前研究較為深入的一種NAD+依賴的蛋白去乙�；�,可以通過使細(xì)胞內(nèi)的組蛋白和非組蛋白脫去乙酰基而調(diào)節(jié)其活性,從而廣泛參與細(xì)胞衰老、能量代謝、腫瘤發(fā)生以及生物節(jié)律等生命過程。已有研究報(bào)道在NAFLD小鼠模型以及臨床NAFLD病人的肝臟中SIRT1表達(dá)明顯下調(diào),而采用SIRT1小分子激動(dòng)劑能顯著改善NAFLD動(dòng)物模型的疾病進(jìn)展,提示SIRT1在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但SIRT1調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝的具體分子機(jī)制尚未闡明。隨著組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和日益成熟,本研究將以SIRT1為切入點(diǎn),借助蛋白質(zhì)和基因組學(xué)技術(shù),闡明SIRT1調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為干預(yù)NAFLD提供特異性的治療靶點(diǎn)�！灸康摹�1.篩選肝臟脂質(zhì)代謝紊亂中SIRT1相關(guān)的關(guān)鍵分子2.篩選及鑒定SIRT1相互作用分子3.明確候選關(guān)鍵分子SULT1E1/SULT2A1在調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝中的作用4.闡明SIRT1調(diào)控候選關(guān)鍵分子參與肝臟脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制【方法】1.將繁殖獲得的肝臟SIRT1特異性敲除的SIRT1~(LKO)小鼠與對照SIRT1~(flox)的小鼠分別給予高脂飲食和普通飲食,誘導(dǎo)NAFLD模型,首先通過實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR),蛋白印跡(Western blot)和免疫組化(IHC)檢測SIRT1~(LKO)小鼠肝臟SIRT1表達(dá)水平,進(jìn)一步通過檢測體重、血糖、血清游離脂肪酸(FFA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、胰島素耐量試驗(yàn)(IPITT)、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)等指標(biāo)確定NAFLD模型的成功建立及觀察小鼠的糖脂代謝和胰島素抵抗水平,進(jìn)一步通過各組小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色觀察SIRT1的缺失在不同飲食狀態(tài)下對小鼠肝臟脂肪變的影響。構(gòu)建FASN-GLuc熒光報(bào)告基因小鼠,并通過體內(nèi)體外成像以及胰島素刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。2.聯(lián)合運(yùn)用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和cDNA基因芯片技術(shù),從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平,高通量篩選小鼠肝臟SIRT1特異性敲除后在不同飲食狀態(tài)下差異表達(dá)基因,并通過生物信息學(xué)技術(shù)分析差異基因所涉及到的信號(hào)通絡(luò),篩選與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的候選分子;利用Q-PCR和Western blot方法檢測候選的關(guān)鍵分子在小鼠肝臟和人肝細(xì)胞系中的表達(dá)水平,最終鎖定2-3個(gè)關(guān)鍵分子進(jìn)行下一步研究。3.采用油酸(oleic acid,OA)或棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導(dǎo)的方法建立體外肝細(xì)胞脂肪變模型,借助細(xì)胞高內(nèi)涵分析系統(tǒng)確定OA和PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變形成的合適濃度和最佳刺激持續(xù)時(shí)間,進(jìn)一步構(gòu)建候選分子SULT1E1/SULT2A1過表達(dá)的人L02肝細(xì)胞系,在OA和PA的合適濃度和最佳刺激持續(xù)時(shí)間作用下,采用脂質(zhì)特異性熒光染料BODIPY或者尼羅紅染色(Nile red)脂滴,通過高內(nèi)涵系統(tǒng)進(jìn)行觀察和定量統(tǒng)計(jì),明確SULT1E1/SULT2A1對肝臟脂質(zhì)代謝的作用,同時(shí)采用Q-PCR和Western blot檢測過表達(dá)SULT1E1/SULT2A1在OA和PA誘導(dǎo)下對肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。4.構(gòu)建帶有Flag標(biāo)簽的SIRT1過表達(dá)L02細(xì)胞系,采用免疫共沉淀技術(shù)富集SIRT1相互作用分子,利用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定SIRT1相互作用分子,通過生物信息學(xué)技術(shù)分析,篩選與脂質(zhì)代謝相關(guān)的互作分子HLTF,并通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí),進(jìn)一步借助轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件預(yù)測HLTF與SULT1E1/SULT2A1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn);構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的HLTF過表達(dá)L02細(xì)胞系,觀察其對脂質(zhì)代謝的影響及對SULT1E1/SULT2A1轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用�！窘Y(jié)果】1.Q-PCR,Western blot和IHC結(jié)果表明SIRT1~(LKO)小鼠肝臟SIRT1的表達(dá)明顯下降,實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞SIRT1特異性敲除;普通飲食的SIRT1~(LKO)小鼠與對照SIRT1~(flox)小鼠的體重、血糖、FFA、ALT和AST的水平無明顯差異,而高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的體重、血糖、血清甘油三脂、ALT和AST水平明顯高于高脂飲食的SIRT1~(flox)小鼠;IPITT和IPGTT試驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的糖耐量受損和胰島素抵抗加重;各組小鼠肝臟HE和油紅O染色結(jié)果顯示高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的肝臟脂肪變更加嚴(yán)重。2.聯(lián)合采用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),cDNA基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù),從蛋白質(zhì)水平和基因mRNA水平高通量篩選SIRT1相關(guān)的參與肝臟脂質(zhì)代謝的分子,其中質(zhì)譜鑒定出上下調(diào)的差異蛋白分別為21個(gè)和10個(gè),基因表達(dá)譜芯片鑒定上下調(diào)差異基因分別為70個(gè)和45個(gè),通過生物信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)差異大部分參與了肝臟的糖、脂、氨基酸代謝,肝臟發(fā)育以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等生物過程,我們重點(diǎn)關(guān)注與脂肪代謝密切相關(guān)10個(gè)候選關(guān)鍵分子;Q-PCR和Western blot結(jié)果表明候選關(guān)鍵分子的表達(dá)受到SIRT1的調(diào)控,并且與組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果一致,最終確定SULT1E1/SULT2A1為后續(xù)研究分子。L02細(xì)胞系中過表達(dá)SIRT1抑制SULT1E1/SULT2A1的基因表達(dá)水平,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SIRT1與SULT1E1/SULT2A1并不存在直接相互作用。3.成功建立SULT1E1/SULT2A1過表達(dá)的人L02肝細(xì)胞系,采用OA和PA成功誘導(dǎo)體外肝細(xì)胞脂肪變模型,通過細(xì)胞高內(nèi)涵分析系統(tǒng)確定在OA100uM和PA200uM誘導(dǎo)12小時(shí)的條件下,肝細(xì)胞脂肪變性非常顯著;在此誘導(dǎo)條件下,油紅染色、BODIPY染色和尼羅紅染色結(jié)果顯示SULT1E1/SULT2A1過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成;Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)SULT1E1/SULT2A1促進(jìn)了脂肪合成相關(guān)基因ChREBP和FASN的表達(dá)。4.通過免疫共沉淀富集SIRT1相互作用蛋白,Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選51個(gè)SIRT1相互作用分子,其中已報(bào)道30個(gè),新發(fā)現(xiàn)21個(gè),經(jīng)過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)鑒定出的相互作用分子主要參與了能量代謝、氧化應(yīng)激等信號(hào)通路,其中HLTF可以與SULT1E1和SULT2A1的啟動(dòng)子區(qū)域。HLTF被選定為重點(diǎn)研究分子,成功建立HLTF過表達(dá)的人L02肝細(xì)胞系,并通過免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)SIRT1-HLTF存在相互作用,發(fā)現(xiàn)SULT1E1/SULT2A1的表達(dá)受到HLTF的調(diào)控。【結(jié)論】1.以高脂飲食誘導(dǎo)SIRT1~(LKO)小鼠NAFLD脂肪變模型,聯(lián)合采用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)分析,本研究獲得了一組與SIRT1密切相關(guān)的參與肝臟脂質(zhì)代謝的分子,并構(gòu)建了肝臟脂質(zhì)代謝障礙中SIRT1介導(dǎo)的分子網(wǎng)絡(luò)圖。2.明確了候選關(guān)鍵分子SULT1E1/SULT2A1通過調(diào)控脂肪代謝相關(guān)基因ChREBP和FASN促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪合成的分子機(jī)制3.通過質(zhì)譜鑒定出一批新的SIRT1相互作用蛋白,免疫共沉淀證實(shí)了HLTF是SIRT1的直接作用分子,進(jìn)一步證實(shí)HLTF可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控SULT1E1/SULT2A1的表達(dá)參與肝臟脂質(zhì)代謝。
【圖文】：

圖 1 NAFLD 疾病譜及病理特征（Cohen JC et al. Science. 2011）前尚無批準(zhǔn)的用于臨床治療 NAFLD 的特異性藥物，各種 NAFLD 臨床控制結(jié)合運(yùn)動(dòng)作為主要治療方法，導(dǎo)致患者依從性差，療效甚微和疾病要原因與我們對 NAFLD 的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足有關(guān)。因此，深入細(xì)致D 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的預(yù)防和治療方法顯得尤為迫切。FLD 的發(fā)病機(jī)制尚未闡明理狀態(tài)下肝臟脂質(zhì)代謝通路臟是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝的主要器官，正常生理狀態(tài)下肝臟內(nèi)的脂質(zhì)代謝以下幾個(gè)方面：在脂肪合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活R-γ），固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c（SREBP-1c）和碳水化合物反應(yīng)元件hREBP）等的調(diào)控下，以及脂肪合成相關(guān)酶類的催化下，以糖等原料從；在脂肪酸 β 氧化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體- （PP下，氧化脂肪酸為機(jī)體提供能量；在肝內(nèi)合成的甘油三酯與 apoB100/a

圖 2 生理狀態(tài)下肝臟 TG 代謝過程（Cohen JC et al. Science. 2011）二次打擊”與“多重平行打擊”假說AFLD 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制極其復(fù)雜并且涉及多個(gè)因素，盡管在這個(gè)領(lǐng)的進(jìn)步，，但對非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然是不全面的，迄D 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。基于 NAFLD 發(fā)生進(jìn)展過程中胰島素抵抗，炎癥反應(yīng)等主要的病理性特征，多種假說被提出用來解釋 NAFLD 發(fā)機(jī)制。其中最早提出被大家廣泛認(rèn)可的是“二次打擊”假說。該假說擊是胰島素抵抗引起的肝內(nèi)脂肪過度聚集形成脂肪變性，而胰島素抵變性又會(huì)加重肝內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，從而形成惡性循環(huán)；第二次打擊是的脂質(zhì)過氧化從而導(dǎo)致肝臟炎癥損傷和肝臟纖維化[10]。但是隨著D 的深入研究發(fā)現(xiàn)“二次打擊”假說過分單純化而不能全面概括 NAFL程中涉及的多個(gè)平行因素，不能很好的用來解釋 NAFLD 的發(fā)病機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575.5

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1 張茂玉;黃承鈺;王旭;洪君蓉;彭恕生;;魔芋食品對人體脂質(zhì)代謝影響的研究[J];四川生理科學(xué)動(dòng)態(tài);1987年01期

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本文編號(hào)：2605442