【摘要】：【背景】隨著肥胖和代謝綜合征(metabolic syndrome,MetS)在全球范圍內的流行,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率正在逐年增加,目前已經成為全球范圍內危害人類健康的主要慢性肝臟疾病。由于NAFLD的發(fā)病機制極為復雜,至今尚未闡明,所以目前仍然沒有批準用于治療NAFLD的藥物。不管是經典的“二次打擊”假說還是近來提出的“多重平行打擊”假說都認為肝臟脂質代謝紊亂引起的肝細胞內脂質的大量過度堆積是引起NAFLD的起始核心機制。因此闡明肝臟細胞內脂質代謝紊亂的分子機制及尋找潛在的NAFLD治療靶點顯得尤為重要。近年研究發(fā)現蛋白的乙酰化/去乙酰修飾在肝臟的能量代謝穩(wěn)態(tài)調節(jié)方面扮演了重要的角色。沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)是目前研究較為深入的一種NAD+依賴的蛋白去乙�；�,可以通過使細胞內的組蛋白和非組蛋白脫去乙�；{節(jié)其活性,從而廣泛參與細胞衰老、能量代謝、腫瘤發(fā)生以及生物節(jié)律等生命過程。已有研究報道在NAFLD小鼠模型以及臨床NAFLD病人的肝臟中SIRT1表達明顯下調,而采用SIRT1小分子激動劑能顯著改善NAFLD動物模型的疾病進展,提示SIRT1在肝臟脂質代謝調控中發(fā)揮關鍵作用。但SIRT1調控肝臟脂質代謝的具體分子機制尚未闡明。隨著組學和生物信息學技術的快速發(fā)展和日益成熟,本研究將以SIRT1為切入點,借助蛋白質和基因組學技術,闡明SIRT1調控肝臟脂質代謝參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制,為干預NAFLD提供特異性的治療靶點�！灸康摹�1.篩選肝臟脂質代謝紊亂中SIRT1相關的關鍵分子2.篩選及鑒定SIRT1相互作用分子3.明確候選關鍵分子SULT1E1/SULT2A1在調控肝臟脂質代謝中的作用4.闡明SIRT1調控候選關鍵分子參與肝臟脂質代謝的分子機制【方法】1.將繁殖獲得的肝臟SIRT1特異性敲除的SIRT1~(LKO)小鼠與對照SIRT1~(flox)的小鼠分別給予高脂飲食和普通飲食,誘導NAFLD模型,首先通過實時定量PCR(Q-PCR),蛋白印跡(Western blot)和免疫組化(IHC)檢測SIRT1~(LKO)小鼠肝臟SIRT1表達水平,進一步通過檢測體重、血糖、血清游離脂肪酸(FFA)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、胰島素耐量試驗(IPITT)、葡萄糖耐量實驗(IPGTT)等指標確定NAFLD模型的成功建立及觀察小鼠的糖脂代謝和胰島素抵抗水平,進一步通過各組小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色觀察SIRT1的缺失在不同飲食狀態(tài)下對小鼠肝臟脂肪變的影響。構建FASN-GLuc熒光報告基因小鼠,并通過體內體外成像以及胰島素刺激實驗進行驗證。2.聯(lián)合運用Label-free定量蛋白質組學技術和cDNA基因芯片技術,從轉錄水平和蛋白表達水平,高通量篩選小鼠肝臟SIRT1特異性敲除后在不同飲食狀態(tài)下差異表達基因,并通過生物信息學技術分析差異基因所涉及到的信號通絡,篩選與脂質代謝密切相關的候選分子;利用Q-PCR和Western blot方法檢測候選的關鍵分子在小鼠肝臟和人肝細胞系中的表達水平,最終鎖定2-3個關鍵分子進行下一步研究。3.采用油酸(oleic acid,OA)或棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導的方法建立體外肝細胞脂肪變模型,借助細胞高內涵分析系統(tǒng)確定OA和PA誘導肝細胞脂肪變形成的合適濃度和最佳刺激持續(xù)時間,進一步構建候選分子SULT1E1/SULT2A1過表達的人L02肝細胞系,在OA和PA的合適濃度和最佳刺激持續(xù)時間作用下,采用脂質特異性熒光染料BODIPY或者尼羅紅染色(Nile red)脂滴,通過高內涵系統(tǒng)進行觀察和定量統(tǒng)計,明確SULT1E1/SULT2A1對肝臟脂質代謝的作用,同時采用Q-PCR和Western blot檢測過表達SULT1E1/SULT2A1在OA和PA誘導下對肝臟脂質代謝相關基因表達的影響。4.構建帶有Flag標簽的SIRT1過表達L02細胞系,采用免疫共沉淀技術富集SIRT1相互作用分子,利用Label-free定量蛋白質組學技術篩選和鑒定SIRT1相互作用分子,通過生物信息學技術分析,篩選與脂質代謝相關的互作分子HLTF,并通過免疫共沉淀實驗證實,進一步借助轉錄因子預測軟件預測HLTF與SULT1E1/SULT2A1啟動子區(qū)域的結合位點;構建帶有HA標簽的HLTF過表達L02細胞系,觀察其對脂質代謝的影響及對SULT1E1/SULT2A1轉錄調控作用�！窘Y果】1.Q-PCR,Western blot和IHC結果表明SIRT1~(LKO)小鼠肝臟SIRT1的表達明顯下降,實現了肝細胞SIRT1特異性敲除;普通飲食的SIRT1~(LKO)小鼠與對照SIRT1~(flox)小鼠的體重、血糖、FFA、ALT和AST的水平無明顯差異,而高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的體重、血糖、血清甘油三脂、ALT和AST水平明顯高于高脂飲食的SIRT1~(flox)小鼠;IPITT和IPGTT試驗結果表明高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的糖耐量受損和胰島素抵抗加重;各組小鼠肝臟HE和油紅O染色結果顯示高脂飲食的SIRT1~(LKO)小鼠的肝臟脂肪變更加嚴重。2.聯(lián)合采用Label-free定量蛋白質組學技術,cDNA基因芯片技術和生物信息學分析技術,從蛋白質水平和基因mRNA水平高通量篩選SIRT1相關的參與肝臟脂質代謝的分子,其中質譜鑒定出上下調的差異蛋白分別為21個和10個,基因表達譜芯片鑒定上下調差異基因分別為70個和45個,通過生物信號通路分析,發(fā)現差異大部分參與了肝臟的糖、脂、氨基酸代謝,肝臟發(fā)育以及內質網應激等生物過程,我們重點關注與脂肪代謝密切相關10個候選關鍵分子;Q-PCR和Western blot結果表明候選關鍵分子的表達受到SIRT1的調控,并且與組學數據結果一致,最終確定SULT1E1/SULT2A1為后續(xù)研究分子。L02細胞系中過表達SIRT1抑制SULT1E1/SULT2A1的基因表達水平,免疫共沉淀實驗結果表明SIRT1與SULT1E1/SULT2A1并不存在直接相互作用。3.成功建立SULT1E1/SULT2A1過表達的人L02肝細胞系,采用OA和PA成功誘導體外肝細胞脂肪變模型,通過細胞高內涵分析系統(tǒng)確定在OA100uM和PA200uM誘導12小時的條件下,肝細胞脂肪變性非常顯著;在此誘導條件下,油紅染色、BODIPY染色和尼羅紅染色結果顯示SULT1E1/SULT2A1過表達促進肝細胞內脂滴形成;Q-PCR和Western blot結果顯示過表達SULT1E1/SULT2A1促進了脂肪合成相關基因ChREBP和FASN的表達。4.通過免疫共沉淀富集SIRT1相互作用蛋白,Label-free定量蛋白質組學技術篩選51個SIRT1相互作用分子,其中已報道30個,新發(fā)現21個,經過生物信息學分析,發(fā)現鑒定出的相互作用分子主要參與了能量代謝、氧化應激等信號通路,其中HLTF可以與SULT1E1和SULT2A1的啟動子區(qū)域。HLTF被選定為重點研究分子,成功建立HLTF過表達的人L02肝細胞系,并通過免疫共沉淀技術證實SIRT1-HLTF存在相互作用,發(fā)現SULT1E1/SULT2A1的表達受到HLTF的調控。【結論】1.以高脂飲食誘導SIRT1~(LKO)小鼠NAFLD脂肪變模型,聯(lián)合采用蛋白質組學和基因組學數據,通過生物信息學分析,本研究獲得了一組與SIRT1密切相關的參與肝臟脂質代謝的分子,并構建了肝臟脂質代謝障礙中SIRT1介導的分子網絡圖。2.明確了候選關鍵分子SULT1E1/SULT2A1通過調控脂肪代謝相關基因ChREBP和FASN促進肝細胞脂肪合成的分子機制3.通過質譜鑒定出一批新的SIRT1相互作用蛋白,免疫共沉淀證實了HLTF是SIRT1的直接作用分子,進一步證實HLTF可以轉錄調控SULT1E1/SULT2A1的表達參與肝臟脂質代謝。
【圖文】：

圖 1 NAFLD 疾病譜及病理特征（Cohen JC et al. Science. 2011）前尚無批準的用于臨床治療 NAFLD 的特異性藥物，各種 NAFLD 臨床控制結合運動作為主要治療方法，導致患者依從性差，療效甚微和疾病要原因與我們對 NAFLD 的發(fā)病機制認識不足有關。因此，深入細致D 發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找有效的預防和治療方法顯得尤為迫切。FLD 的發(fā)病機制尚未闡明理狀態(tài)下肝臟脂質代謝通路臟是人體內脂質代謝的主要器官，正常生理狀態(tài)下肝臟內的脂質代謝以下幾個方面：在脂肪合成相關轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活R-γ），固醇調節(jié)元件結合蛋白 1c（SREBP-1c）和碳水化合物反應元件hREBP）等的調控下，以及脂肪合成相關酶類的催化下，以糖等原料從；在脂肪酸 β 氧化相關轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體- （PP下，氧化脂肪酸為機體提供能量；在肝內合成的甘油三酯與 apoB100/a

圖 2 生理狀態(tài)下肝臟 TG 代謝過程（Cohen JC et al. Science. 2011）二次打擊”與“多重平行打擊”假說AFLD 發(fā)生發(fā)展的分子機制極其復雜并且涉及多個因素，盡管在這個領的進步，，但對非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制的認識仍然是不全面的，迄D 的發(fā)病機制尚未完全闡明�；� NAFLD 發(fā)生進展過程中胰島素抵抗，炎癥反應等主要的病理性特征，多種假說被提出用來解釋 NAFLD 發(fā)機制。其中最早提出被大家廣泛認可的是“二次打擊”假說。該假說擊是胰島素抵抗引起的肝內脂肪過度聚集形成脂肪變性，而胰島素抵變性又會加重肝內脂質代謝紊亂，從而形成惡性循環(huán)；第二次打擊是的脂質過氧化從而導致肝臟炎癥損傷和肝臟纖維化[10]。但是隨著D 的深入研究發(fā)現“二次打擊”假說過分單純化而不能全面概括 NAFL程中涉及的多個平行因素，不能很好的用來解釋 NAFLD 的發(fā)病機制。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.5

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1 張茂玉;黃承鈺;王旭;洪君蓉;彭恕生;;魔芋食品對人體脂質代謝影響的研究[J];四川生理科學動態(tài);1987年01期

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本文編號：2605442