【摘要】：化學(xué)物質(zhì)肝臟代謝主要分為兩相,Ⅰ相代謝(phase 1)主要是體內(nèi)小分子物質(zhì)(如谷胱甘肽、葡糖醛酸、維生素E等)直接與氧化物或毒性物質(zhì)反應(yīng),使其失活減少毒性,此反應(yīng)為快速反應(yīng)。Ⅱ相代謝(phase 2)是酶促反應(yīng),在Ⅱ相代謝酶如過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase)、磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotranserase)、乙�；D(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)、醌氧化還原酶I (quinone oxidoreductasel,NQO1)等的催化下,將內(nèi)源性極性小分子物質(zhì)經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合到外來物質(zhì)或Ⅰ相代謝活化物的分子上,使之親水性增強(qiáng),促進(jìn)其排出體外。它們能消除有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體DNA及生物功能蛋白的破壞,以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,因此誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá)可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化、抗突變和抗腫瘤的能力。Ⅱ相代謝酶的啟動(dòng)子區(qū)域有特定的DNA序列即抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element, ARE),可通過化學(xué)預(yù)防劑、氧化應(yīng)激或者親電子物質(zhì)誘導(dǎo)激活。 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2)屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)蛋白質(zhì)家族,是包括p45、Nrf1、Nrf2、Nrf3在內(nèi)的CNC(cap'n'collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,主要在代謝性和解毒組織器官中表達(dá),如肝臟、腎臟及其它持續(xù)暴露于環(huán)境中的組織如皮膚、肺、消化管等。Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過與抗氧化反應(yīng)元件相互作用,可上調(diào)多種抗氧化酶及解毒酶,提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達(dá)水平,維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài),發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Nrf2生理狀態(tài)下位于細(xì)胞質(zhì)中,與胞漿蛋白伴侶分子Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1)結(jié)合,處于無活性狀態(tài),并瞬即降解。Keap1是一個(gè)與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合的含624個(gè)氨基酸的多肽,包含NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、CTR5個(gè)區(qū)。DGR區(qū)(double glycine repeat, DGR)含有6個(gè)雙甘氨酸重復(fù)序列,是Keap1與Nrf2的Neh2區(qū)結(jié)合位點(diǎn),也是Keap1與胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)位。BTB/POZ區(qū)的作用是介導(dǎo)Keap1二聚體化并與Nrf2-Keap1結(jié)合力有關(guān),BTB/POZ區(qū)Ser-104突變影響Keap1二聚體化,可干擾Keap1錨定Nrf2的功能。Keap1與親電子化合物及氧化劑的反應(yīng)發(fā)生在插入?yún)^(qū)IVR,這與IVR區(qū)富含半胱氨酸有關(guān)。同時(shí)IVR區(qū)參與泛素化連接酶形成,因此與Nrf2穩(wěn)定性有關(guān)。在活性氧或其他親核劑信號(hào)刺激下,Keap1或者Keap1的DGR區(qū)構(gòu)象發(fā)生變化,Nrf2進(jìn)而從Keap1上解離出來,Nrf2與Keap1解偶聯(lián)后被激活轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中,和其他蛋白質(zhì)Maf、JunD、cJun、ATF4等結(jié)合形成穩(wěn)定異二聚體后,與位于Ⅱ相代謝酶基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件上的GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá),增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性或耐受性。由此可見Keap1-Nrf2-ARE通路在Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。目前研究證實(shí),Keap1-Nrf2-ARE通路在抗腫瘤、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)GSH合成、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及調(diào)節(jié)心腦血管反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮著廣泛的細(xì)胞保護(hù)功能,Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)是抵抗各種環(huán)境應(yīng)激和內(nèi)源性應(yīng)激防御機(jī)制中必不可少的部分。Nrf2缺失或激活障礙可導(dǎo)致幾種常見的病理現(xiàn)象,包括化學(xué)物致腫瘤形成的易感性、藥源性急性肝毒性、對(duì)外來化合物以及紫外線的敏感性增高。目前Keap1-Nrf2-ARE通路的誘導(dǎo)物主要有邁克爾反應(yīng)受體類(michael reaction acceptors)、聯(lián)苯芬類(diphenols)、苯醌類(quinones)、異硫氰酸鹽(isothiocyanates)、過氧化物類(peroxides)、硫醇類(mercaptans)、三價(jià)砷類(trivalent arsenicals)、重金屬類(heavy metals)。 臭氧(ozone,O3)是氧氣的同素異構(gòu)體,由3個(gè)氧原子組成的分子,空氣中不穩(wěn)定、常溫常壓下半衰期約45 min轉(zhuǎn)化成氧氣。臭氧可溶于水,5分鐘達(dá)到飽和,溶解度隨著注入蒸餾水的臭氧濃度的增大而升高,相同條件下溶解度為氧氣的10倍,5℃條件下臭氧水半衰期為110小時(shí)。醫(yī)用臭氧是指由醫(yī)用純氧通過濃度可精密調(diào)控的臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的氧氣與臭氧的混合氣體,可用于臨床治療。醫(yī)用臭氧被認(rèn)為是二十世紀(jì)新的氣體分子藥物。醫(yī)用臭氧由于具有改善循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫及抗炎鎮(zhèn)痛等功能,現(xiàn)已用于創(chuàng)傷或褥瘡愈合、椎間盤突出癥、外周血管疾病、病毒性肝炎、糖尿病、腫瘤輔助治療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎及疼痛等治療。醫(yī)用臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑,適當(dāng)?shù)膭┝亢洼^小的濃度,可以誘導(dǎo)Ⅱ相抗氧化酶的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)用臭氧直腸灌注預(yù)處理后能夠減輕CCl4所致犬肝損傷,但其作用機(jī)制尚不清楚。醫(yī)用臭氧自體血回輸療法是臭氧全身應(yīng)用治療的主要方法,已應(yīng)用30余年,盡管副作用少安全性高,但需要抽血100ml用于體外臭氧化,受外周血管狀況的影響,臨床應(yīng)用不方便。探索臭氧化液體靜脈輸注方法替代臭氧自體血療法的努力一直未間斷。1994年Bocci等發(fā)現(xiàn)生理鹽水亦可臭氧化,能很好地保存臭氧及其衍生物,但認(rèn)為高濃度臭氧化生理鹽水(臭氧濃度80μg/ml)靜滴對(duì)血管有刺激性,靜脈滴注可能引起化學(xué)性靜脈炎。俄羅斯學(xué)者臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)低濃度臭氧化生理鹽水靜脈滴注與臭氧自血治療一樣對(duì)一些患者有效,無明顯副作用。 基于以上認(rèn)識(shí),本研究嘗試用醫(yī)用臭氧溶于生理鹽水制成飽和的臭氧鹽水(Ozonized Saline,OS),利用CCl4大鼠急性肝損傷動(dòng)物模型,來探討靜脈應(yīng)用臭氧鹽水對(duì)CCl4中毒大鼠肝臟的治療保護(hù)作用及其作用機(jī)理,為醫(yī)用臭氧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分臭氧化鹽水對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 方法： 采用40只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為8組,每組5只。第1組：正常對(duì)照組(NC組)；第2組：O2鹽水組(模型組)；第3～8組：OS組(實(shí)驗(yàn)組),OS組(分為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml6個(gè)不同濃度組)予5ml/kg OS、模型組予5ml/kg氧氣鹽水每日尾靜脈注射,連續(xù)15天,第16天予50%CCl4橄欖油溶液2ml/kg腹腔注射造肝損傷模型。正常對(duì)照組無任何預(yù)處理,正常喂養(yǎng)15天,第16天予橄欖油溶液2ml/kg腹腔注射1次。CCl4造�；蜷蠙煊腿芤鹤⑸�24小時(shí)后,檢測(cè)大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肝組織總抗氧化能力(TAOC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)水平。提取大鼠肝組織的核蛋白,運(yùn)用免疫印跡方法測(cè)定其細(xì)胞核中Nrf2的含量,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2的分布。 結(jié)果： 1)與NC組比較,模型組ALT、AST均顯著升高(P0.01),肝組織TAOC、GSH、GPx、CAT顯著降低(P0.01),模型成功。 2)與NC組比較,不同臭氧濃度OS組ALT、AST顯著升高(P0.05),肝組織TAOC、GSH、GPx、CAT降低,部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3)與模型組比較,5～50μg/ml6個(gè)不同臭氧濃度OS組ALT、AST均顯著降低(P0.05),不同濃度OS組ALT、AST水平亦不同,以30μg/mlOS組最低,ALT、AST較模型組分別降低56.5%(P=0.007)、56.2%(P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,30μg/mlOS組ALT、AST與其他濃度的OS組比較部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4)與模型組比較,5～50μg/ml6個(gè)不同臭氧濃度OS組TAOC、GSH、GPx、CAT升高,部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中30μg/mlOS組TAOC、GSH、GPx、CAT較模型組分別升高90.3%(P=0.000)、114.3%(P=0.000)、51.3%(P=0.001)、50.1%(P=0.013),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5)不同濃度OS組對(duì)大鼠抗氧化系統(tǒng)的影響亦不同,30μg/mlOS組TAOC、GSH、GPx、CAT與其他OS組比較,部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 6)與NC組、模型組比較,OS組可明顯增加Nrf2在細(xì)胞核中的含量,不同濃度OS所誘導(dǎo)的Nrf2含量也有差別,其中20-40μg/mlOS組含量較高。 7)各臭氧濃度OS靜脈注射,大鼠未見化學(xué)性靜脈炎、體重不升和大鼠死亡等不良事件發(fā)生。 第二部分30ug/ml臭氧化鹽水對(duì)大鼠正常肝組織細(xì)胞的抗氧化能力的影響 方法： 根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)的氧化損傷模型參數(shù),采用10只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為2組,每組5只。第1組：正常對(duì)照組(NC組)；第2組：30μg/ml OS組(實(shí)驗(yàn)組)。OS組予5ml/kg OS每日尾靜脈注射,連續(xù)15天,第16天予3%戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉處死動(dòng)物。正常對(duì)照組無任何預(yù)處理,正常喂養(yǎng)15天,第16天亦予3%戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉處死。手術(shù)留取肝組織,檢測(cè)TAOC、GPx、CAT活性,利用免疫印跡法檢測(cè)肝細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的含量,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2的分布。 結(jié)果： 1)與NC組比較,30ug/mlOS預(yù)處理可使大鼠肝組織TAOC、GPx、CAT活性升高,分別升高TAOC活性升高31.4%(P=0.005),GPx升高21.0%(P=0.023),CAT活性升高14.2%(P=0.040),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2)免疫印跡及免疫熒光均顯示OS能增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)。 全文結(jié)論： 1)臭氧化鹽水靜脈注射預(yù)處理可使CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷減輕； 2)臭氧化鹽水對(duì)CCl4中毒大鼠肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,以臭氧濃度為30μg/ml臭氧化鹽水療效最佳； 3)臭氧化鹽水可以通過激活大鼠肝組織細(xì)胞Keap1-Nrf2-ARE通路,誘導(dǎo)抗氧化酶的合成、提高大鼠總抗氧化能力來保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激損傷。Keap1-Nrf2-ARE通路的激活在臭氧抗氧化過程中發(fā)揮了作用。
【圖文】：

圖1Keapl一NrfZ一ARE通路調(diào)節(jié)機(jī)制Figurel.regulatingmeehanismofKeaPl一NrfZ一AREPathway研究證實(shí)，KeaPI一NrfZ一ARE通路在抗腫瘤、抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)GSH合成、凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及調(diào)節(jié)心腦血管反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)等方
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575

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