【摘要】： 研究背景與目的 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)作為一種自身免疫性肝病,其組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性損傷,并最終可導(dǎo)致肝纖維化,肝硬化。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查資料顯示PBC的流行率在20~240/100萬人口,我國(guó)PBC的發(fā)病狀況目前尚缺乏權(quán)威性流行病學(xué)資料,近20年來隨著血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody,AMA)及其亞型等自身抗體檢測(cè)的開展,以及PBC臨床病理認(rèn)識(shí)的提高,研究報(bào)道和臨床診斷PBC的病例呈大幅度上升態(tài)勢(shì),有學(xué)者認(rèn)為我國(guó)PBC的發(fā)病率甚至高于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,因此,PBC作為我國(guó)重要的非病毒性肝病之一,其危害性不容忽視。 PBC發(fā)病的始動(dòng)因素及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。國(guó)外研究資料顯示,環(huán)境因素作用與易感機(jī)體是導(dǎo)致PBC免疫功能紊亂的重要因素。有人認(rèn)為某些病原體可能通過分子模擬機(jī)制啟動(dòng)PBC的發(fā)生,部分感染性因素與PBC發(fā)生乃至進(jìn)展之間的相關(guān)性已初露端倪,但現(xiàn)有的研究證據(jù)尚不充分的;也有報(bào)道稱并非病原微生物直接導(dǎo)致了自身免疫的啟動(dòng),而是易感機(jī)體發(fā)生了不適當(dāng)?shù)目垢腥久庖叻磻?yīng),激發(fā)PBC的發(fā)生。本課題通過人體材料研究與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合,在體與離體研究相結(jié)合,多學(xué)科研究相交叉,較系統(tǒng)地從臨床病理、感染因素及免疫病理角度,研究PBC的臨床病理改變及LPS在其發(fā)病中的作用,旨在分析PBC的臨床病理及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn),提高對(duì)PBC的認(rèn)識(shí)及診斷水平,探討G-桿菌細(xì)胞壁共有成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其受體在PBC肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用和地位,并分析PBC患者的抗感染免疫反應(yīng)狀態(tài),從感染性因素這一全新的角度闡述PBC的發(fā)生、進(jìn)展及免疫損傷機(jī)制,進(jìn)而為臨床上PBC可能的抗感染治療,以及臨床治療性干預(yù)時(shí)機(jī)的選擇,乃至PBC的早期預(yù)防提供理論依據(jù)和新的思路或策略。 方法 收集解放軍302醫(yī)院2001～2007年期間經(jīng)病理確診的臨床資料完整的100例PBC病例,對(duì)其一般資料、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理學(xué)改變等進(jìn)行了回顧性分析;采用鱟試劑盒及ELISA方法分別檢測(cè)PBC患者血清中LPS水平,以及炎癥細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平;免疫組織化學(xué)染色原位檢測(cè)LPS受體CD14、TLR4、CD68及NF-κB的表達(dá);分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC中CD14陽性單核細(xì)胞的頻數(shù)及LPS對(duì)單核細(xì)胞TLR4、CD83表達(dá)的影響,ELISA檢測(cè)上清中促炎細(xì)胞因子的濃度,分析機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)狀態(tài);采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及Western blotting技術(shù)檢測(cè)LPS刺激人源性膽管上皮細(xì)胞后TLR4表達(dá)變化,ELISA方法測(cè)定LPS刺激后膽管上皮細(xì)胞分泌促炎因子的變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)及雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步明確肝組織原位免疫細(xì)胞的變化及引起膽管損傷的免疫細(xì)胞類型。 結(jié)果 1.臨床、實(shí)驗(yàn)室資料與肝穿刺病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),本組病例中PBC患者以中年女性多見,占89%;最常見癥狀是乏力,其次是黃疸、皮膚瘙癢,多數(shù)病例血清膽紅素升高,且以直接膽紅素升高為主,患者血清ALP、γ-GGT升高3~4倍以上,但隨著病情進(jìn)展二者均有所下降。本組患者AMA的陽性率為70%。AMA陽性和陰性患者IgM升高的比例上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。PBC的組織病理學(xué)改變主要位于匯管區(qū)及其周圍,小葉內(nèi)病變較輕。早期主要表現(xiàn)為小葉間膽管的損傷及小膽管的增生;單個(gè)核細(xì)胞聚集性浸潤(rùn),形成淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu),多圍繞損傷的膽管和增生的小膽管。晚期表現(xiàn)為匯管區(qū)擴(kuò)大、纖維化、纖維間隔及假小葉形成、肝硬化。 2. PBC患者血清LPS及主要促炎細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平升高,且隨病程進(jìn)展而增加,并與血生化指標(biāo)ALP、TB、DB相關(guān);LPS受體TLR4、CD14及下游分子NF-κB在肝組織內(nèi)的表達(dá)也隨疾病進(jìn)展而上調(diào),尤其是膽管上皮中TLR4的表達(dá)水平在PBC患者明顯上調(diào)。 3.新鮮分離的PBMC中,PBC患者CD14頻數(shù)明顯高于正常人,二者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著(P0.01);與正常人比較,LPS刺激后PBC患者CD14陽性細(xì)胞表面TLR4、CD83蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),促炎細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌增加,PBC患者單核細(xì)胞對(duì)LPS刺激具有高反應(yīng)性。 4.采用人源性膽管上皮細(xì)胞系體外培養(yǎng),與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(2hr、8hr、24hr)LPS作用的正常人膽管上皮細(xì)胞比較,PBC患者源性膽管上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)水平均有所升高(P0.05);8hr、24hr時(shí)間點(diǎn)促炎細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8生成明顯上調(diào)(P0.01)。PBC患者膽管上皮細(xì)胞較正常人膽管上皮細(xì)胞對(duì)LPS刺激反應(yīng)性更為敏感。 5.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常肝組織相比較,PBC患者肝組織匯管區(qū)內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD83+及小葉內(nèi)CD57+免疫細(xì)胞數(shù)量增多,其中早期組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞比例偏高,損傷的小膽管周圍主要為CD8+、CD4+細(xì)胞;晚期組各免疫細(xì)胞數(shù)目均有所減少。 結(jié)論 1.PBC臨床特征表現(xiàn)為:起病隱匿,臨床表現(xiàn)多樣化,最常見癥狀是乏力,其次是黃疸、皮膚瘙癢等,血清AMA是其較特異性抗體標(biāo)志物,肝功能血清酶學(xué)檢查血以ALP、γ-GGT明顯升高,轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)輕~中等度升高為其特點(diǎn)。對(duì)于癥狀不典型及血清檢測(cè)無特異性的PBC患者,需依據(jù)肝穿刺檢查確診PBC,以避免漏、誤診。 2.LPS在PBC肝損傷中可能發(fā)揮了較重要的作用,推測(cè)LPS可能通過其受體直接引起肝內(nèi)小膽管(直徑40-80μm)及肝細(xì)胞損傷,并可能通過促炎因子間接誘導(dǎo)膽管上皮損傷及肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生與發(fā)展,推測(cè)可能為新的PBC病理?yè)p傷機(jī)制。 3.PBC患者外周血中LPS水平明顯升高,并與臨床病理分期相關(guān),顯示LPS水平檢測(cè)有可能作為PBC診斷及病情進(jìn)展的參考指標(biāo)之一,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 4.肝組織內(nèi)多種免疫活性細(xì)胞數(shù)目、比例及分布上有其特點(diǎn),結(jié)果提示PBC肝內(nèi)小膽管樹損傷是以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫損傷為主。PBC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)LPS具有高反應(yīng)性,推測(cè)包括LPS在內(nèi)的一些刺激因素可能通過激發(fā)系列促炎細(xì)胞因子的生成,在機(jī)體免疫平衡的失調(diào)中發(fā)揮作用,可能為PBC的發(fā)病機(jī)制之一。
【圖文】：

圖 16 肝組織內(nèi) CD68 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖 4 PBC 早期組肝組織，匯管區(qū)部分單個(gè)核細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)（IHC，×200）圖 3 正常肝組織內(nèi)難覓 TLR4 陽性細(xì)胞（IHC，×200）圖 3圖 4正常 PBC 早期組 PBC 晚期組分組

圖 4 PBC 早期組肝組織，，匯管區(qū)部分單個(gè)核細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)（IHC，×200）圖 3 正常肝組織內(nèi)難覓 TLR4 陽性細(xì)胞（IHC，×200）圖 6圖 5圖 5、6 PBC 晚期組肝組織，匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞 TLR4 陽性表達(dá)（IHC，×200）圖 6 右上角插圖為 TLR4 陽性膽管上皮細(xì)胞高倍觀察（IHC，×400）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2603602