【摘要】： 研究背景與目的 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)作為一種自身免疫性肝病,其組織學(xué)特點表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進行性損傷,并最終可導(dǎo)致肝纖維化,肝硬化。國外流行病學(xué)調(diào)查資料顯示PBC的流行率在20~240/100萬人口,我國PBC的發(fā)病狀況目前尚缺乏權(quán)威性流行病學(xué)資料,近20年來隨著血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody,AMA)及其亞型等自身抗體檢測的開展,以及PBC臨床病理認識的提高,研究報道和臨床診斷PBC的病例呈大幅度上升態(tài)勢,有學(xué)者認為我國PBC的發(fā)病率甚至高于國外文獻報道,因此,PBC作為我國重要的非病毒性肝病之一,其危害性不容忽視。 PBC發(fā)病的始動因素及發(fā)病機制尚不清楚。國外研究資料顯示,環(huán)境因素作用與易感機體是導(dǎo)致PBC免疫功能紊亂的重要因素。有人認為某些病原體可能通過分子模擬機制啟動PBC的發(fā)生,部分感染性因素與PBC發(fā)生乃至進展之間的相關(guān)性已初露端倪,但現(xiàn)有的研究證據(jù)尚不充分的;也有報道稱并非病原微生物直接導(dǎo)致了自身免疫的啟動,而是易感機體發(fā)生了不適當(dāng)?shù)目垢腥久庖叻磻?yīng),激發(fā)PBC的發(fā)生。本課題通過人體材料研究與實驗研究相結(jié)合,在體與離體研究相結(jié)合,多學(xué)科研究相交叉,較系統(tǒng)地從臨床病理、感染因素及免疫病理角度,研究PBC的臨床病理改變及LPS在其發(fā)病中的作用,旨在分析PBC的臨床病理及實驗室特點,提高對PBC的認識及診斷水平,探討G-桿菌細胞壁共有成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其受體在PBC肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用和地位,并分析PBC患者的抗感染免疫反應(yīng)狀態(tài),從感染性因素這一全新的角度闡述PBC的發(fā)生、進展及免疫損傷機制,進而為臨床上PBC可能的抗感染治療,以及臨床治療性干預(yù)時機的選擇,乃至PBC的早期預(yù)防提供理論依據(jù)和新的思路或策略。 方法 收集解放軍302醫(yī)院2001～2007年期間經(jīng)病理確診的臨床資料完整的100例PBC病例,對其一般資料、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及病理學(xué)改變等進行了回顧性分析;采用鱟試劑盒及ELISA方法分別檢測PBC患者血清中LPS水平,以及炎癥細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平;免疫組織化學(xué)染色原位檢測LPS受體CD14、TLR4、CD68及NF-κB的表達;分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),流式細胞術(shù)檢測PBMC中CD14陽性單核細胞的頻數(shù)及LPS對單核細胞TLR4、CD83表達的影響,ELISA檢測上清中促炎細胞因子的濃度,分析機體抗感染免疫反應(yīng)狀態(tài);采用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)及Western blotting技術(shù)檢測LPS刺激人源性膽管上皮細胞后TLR4表達變化,ELISA方法測定LPS刺激后膽管上皮細胞分泌促炎因子的變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)及雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色進一步明確肝組織原位免疫細胞的變化及引起膽管損傷的免疫細胞類型。 結(jié)果 1.臨床、實驗室資料與肝穿刺病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),本組病例中PBC患者以中年女性多見,占89%;最常見癥狀是乏力,其次是黃疸、皮膚瘙癢,多數(shù)病例血清膽紅素升高,且以直接膽紅素升高為主,患者血清ALP、γ-GGT升高3~4倍以上,但隨著病情進展二者均有所下降。本組患者AMA的陽性率為70%。AMA陽性和陰性患者IgM升高的比例上存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。PBC的組織病理學(xué)改變主要位于匯管區(qū)及其周圍,小葉內(nèi)病變較輕。早期主要表現(xiàn)為小葉間膽管的損傷及小膽管的增生;單個核細胞聚集性浸潤,形成淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu),多圍繞損傷的膽管和增生的小膽管。晚期表現(xiàn)為匯管區(qū)擴大、纖維化、纖維間隔及假小葉形成、肝硬化。 2. PBC患者血清LPS及主要促炎細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平升高,且隨病程進展而增加,并與血生化指標(biāo)ALP、TB、DB相關(guān);LPS受體TLR4、CD14及下游分子NF-κB在肝組織內(nèi)的表達也隨疾病進展而上調(diào),尤其是膽管上皮中TLR4的表達水平在PBC患者明顯上調(diào)。 3.新鮮分離的PBMC中,PBC患者CD14頻數(shù)明顯高于正常人,二者之間統(tǒng)計學(xué)差異非常顯著(P0.01);與正常人比較,LPS刺激后PBC患者CD14陽性細胞表面TLR4、CD83蛋白表達量明顯上調(diào),促炎細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌增加,PBC患者單核細胞對LPS刺激具有高反應(yīng)性。 4.采用人源性膽管上皮細胞系體外培養(yǎng),與對應(yīng)時間點(2hr、8hr、24hr)LPS作用的正常人膽管上皮細胞比較,PBC患者源性膽管上皮細胞TLR4表達水平均有所升高(P0.05);8hr、24hr時間點促炎細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8生成明顯上調(diào)(P0.01)。PBC患者膽管上皮細胞較正常人膽管上皮細胞對LPS刺激反應(yīng)性更為敏感。 5.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常肝組織相比較,PBC患者肝組織匯管區(qū)內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD83+及小葉內(nèi)CD57+免疫細胞數(shù)量增多,其中早期組CD3+、CD4+、CD8+細胞比例偏高,損傷的小膽管周圍主要為CD8+、CD4+細胞;晚期組各免疫細胞數(shù)目均有所減少。 結(jié)論 1.PBC臨床特征表現(xiàn)為:起病隱匿,臨床表現(xiàn)多樣化,最常見癥狀是乏力,其次是黃疸、皮膚瘙癢等,血清AMA是其較特異性抗體標(biāo)志物,肝功能血清酶學(xué)檢查血以ALP、γ-GGT明顯升高,轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)輕~中等度升高為其特點。對于癥狀不典型及血清檢測無特異性的PBC患者,需依據(jù)肝穿刺檢查確診PBC,以避免漏、誤診。 2.LPS在PBC肝損傷中可能發(fā)揮了較重要的作用,推測LPS可能通過其受體直接引起肝內(nèi)小膽管(直徑40-80μm)及肝細胞損傷,并可能通過促炎因子間接誘導(dǎo)膽管上皮損傷及肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生與發(fā)展,推測可能為新的PBC病理損傷機制。 3.PBC患者外周血中LPS水平明顯升高,并與臨床病理分期相關(guān),顯示LPS水平檢測有可能作為PBC診斷及病情進展的參考指標(biāo)之一,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。 4.肝組織內(nèi)多種免疫活性細胞數(shù)目、比例及分布上有其特點,結(jié)果提示PBC肝內(nèi)小膽管樹損傷是以Th1介導(dǎo)的細胞免疫損傷為主。PBC患者外周血單個核細胞對LPS具有高反應(yīng)性,推測包括LPS在內(nèi)的一些刺激因素可能通過激發(fā)系列促炎細胞因子的生成,在機體免疫平衡的失調(diào)中發(fā)揮作用,可能為PBC的發(fā)病機制之一。
【圖文】：

圖 16 肝組織內(nèi) CD68 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖 4 PBC 早期組肝組織，匯管區(qū)部分單個核細胞及膽管上皮細胞TLR4陽性表達（IHC，×200）圖 3 正常肝組織內(nèi)難覓 TLR4 陽性細胞（IHC，×200）圖 3圖 4正常 PBC 早期組 PBC 晚期組分組

圖 4 PBC 早期組肝組織，，匯管區(qū)部分單個核細胞及膽管上皮細胞TLR4陽性表達（IHC，×200）圖 3 正常肝組織內(nèi)難覓 TLR4 陽性細胞（IHC，×200）圖 6圖 5圖 5、6 PBC 晚期組肝組織，匯管區(qū)膽管上皮細胞及單個核細胞 TLR4 陽性表達（IHC，×200）圖 6 右上角插圖為 TLR4 陽性膽管上皮細胞高倍觀察（IHC，×400）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2603602