發(fā)布時間：2020-03-26 20:18

【摘要】：目的：通過SHBs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞，，觀察SHBs蛋白對肝細胞及細胞中ECHS1、PPARɑ及其調(diào)控下游基因表達的影響，為研究SHBs的生物學(xué)功能提供新線索，探討HBV感染者脂肪肝的形成機理。 方法：以C型HBV全S基因為模板，PCR擴增主S基因（SHBs基因），定向克隆至pcDNA3.1（+）載體中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SHBs；確定HepG2細胞G418的最佳篩選濃度，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SHBs與空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞，G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，通過RT-PCR和ELISA方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中SHBsmRNA和蛋白以驗證獲得的表達細胞株，并用實時定量PCR和Western-Blot方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白水平表達差異。 結(jié)果：成功構(gòu)建出SHBs真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SHBs。確定HepG2細胞G418的最佳篩選濃度為1000ug/ml。以G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，并成功建立穩(wěn)定表達目的蛋白的HepG2-pn3.1-SHBs細胞及空質(zhì)粒對照的HepG2-pn3.1-neo。RT-PCR和ELISA方法檢測到HepG2-pn3.1-SHBs細胞株中目的蛋白SHBs的表達，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HepG2-pn3.1-SHBs細胞株持續(xù)表達SHBs。與HepG2-pn3.1-neo細胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs細胞中細胞培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的含量較高[（46.80±4.78）vs（39.21±2.81）；（64.72±5.45）vs（54.58±1.20）,（p0.01）]，細胞裂解液中CHO含量較高[（0.87±0.04）vs（0.87±0.04）,（p0.01）]，而TG含量較低[（1.39±0.65）vs（0.58±0.05）,（p0.01）]。實時定量PCR結(jié)果顯示：與HepG2-pn3.1-neo細胞相比，HepG2-pn3.1-SHBs細胞中基因ECHS1、APOA1、LPLmRNA表達水平較低[（0.161±0.043）vs（0.210±0.022）,（p0.05）；（0.031±0.007）vs（0.094±0.055）,（p0.05）；（0.770±0.036）vs（0.982±0.031）]，基因ACC、SREBP-1cmRNA水平較高[（0.113±0.027）vs（0.059±0.022）,（p0.01）；（0.019±0.002）vs（0.015±0.001）,（p0.05）],差異有統(tǒng)計學(xué)意義，基因CPT1a、PPARα的轉(zhuǎn)錄水平差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但呈減弱趨勢[（0.028±0.005）vs（0.030±0.004）；（0.014±0.004）vs（0.015±0.002）]。Western-Blot結(jié)果顯示上述基因蛋白水平的變化趨勢與mRNA一致。Western-Blot結(jié)果顯示上述基因蛋白水平的變化趨勢與mRNA一致。 結(jié)論：結(jié)果表明SHBs對肝細胞可以造成一定的損害作用，并干擾脂肪酸代謝，在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平明顯改變脂肪酸合成、分解相關(guān)基因的表達，但HBsAg是否直接導(dǎo)致肝細胞脂肪變性尚不明確，值得進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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