【摘要】： 目的：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種促肝纖維化的重要細(xì)胞因子,是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì)。CTGF可直接介導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)活化、增殖及遷移,還能促進(jìn)活化HSC的合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)也是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì),在肝纖維化發(fā)生時(shí),它主要由激活的HSC表達(dá)。TIMP-1不僅抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)活性阻止膠原降解,也通過(guò)抑制HSC凋亡、促進(jìn)膠原分泌而在肝纖維化病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所以,減少CTGF和TIMP-1的表達(dá),可以減輕肝纖維化程度。本研究旨在構(gòu)建以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)表達(dá)載體,為進(jìn)一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。方法：根據(jù)前期篩選出的對(duì)CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干擾靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt,按照RNA干擾(RNA interference, RNAi)序列設(shè)計(jì)原則,各設(shè)計(jì)1對(duì)含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列,退火形成雙鏈DNA,分別克隆到經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒載體psiRNA-DUO-GFPzeo,構(gòu)建成含目的靶基因片段的重組質(zhì)粒載體psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切瓊脂糖電泳和測(cè)序鑒定。體外復(fù)蘇培養(yǎng)大鼠的肝星狀細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化,3×105／ml接種于六孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右融合時(shí),無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化,利用脂質(zhì)體(TransFast Transfmlection Reagent) 2000介導(dǎo),將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒(psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1)及空載體psiRNA-DUO-GFPzeo瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠的肝星狀細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況,用流式細(xì)胞儀測(cè)轉(zhuǎn)染的效率。結(jié)果：1、證實(shí)以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的表達(dá)shRNA的目的基因片段分別被成功的克隆到質(zhì)粒載體psiRNA-DUO-GFPzeo中,測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計(jì)的靶基因片段完全一致。2：用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察,在轉(zhuǎn)染進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)胞全部發(fā)綠色熒光,初步證實(shí)能轉(zhuǎn)染進(jìn)肝星狀細(xì)胞。結(jié)論：成功構(gòu)建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達(dá)質(zhì)粒重組體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)染大鼠的肝星狀細(xì)胞,在熒光顯微鏡能發(fā)現(xiàn)帶有熒光的細(xì)胞,說(shuō)明成功轉(zhuǎn)染進(jìn)肝星狀細(xì)胞。這樣為進(jìn)一步探索肝纖維化基因治療的新途徑打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌藍(lán)白篩選Fig.1Blue一whitescreeningofPlasmidtransformationofE.eoli酶切鑒定提取的空載質(zhì)粒Ps訊NA一DUO一GFPzeo用內(nèi)切酶Hindm單酶瓊脂糖電泳鑒定，并與空載質(zhì)粒Hindm單酶切后產(chǎn)物用0.8%鑒定做對(duì)比(見(jiàn)圖2)。通過(guò)酶切后電泳圖譜分析，可以看到提粒與用于轉(zhuǎn)化的空載質(zhì)粒符合理論預(yù)期，是同一質(zhì)粒載體。切反應(yīng)體系如下:取的空載質(zhì)粒PsiRNA一DUO一GFPzeo用Hindlll單酶切反應(yīng)體的空載質(zhì)粒2川

輕輕混勻后，37oC水浴加熱3h，后置80℃水浴20min滅活，即用或一20OC保存?zhèn)溆�。空質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物0.8%瓊脂糖電泳鑒定，見(jiàn)圖2 M:makerDNAS林l，6X緩之中液l林l;l:提取空載質(zhì)粒5林l，6X緩之，}‘液l林l;2:空載質(zhì)粒5排l，6X緩沖液l林l; M:Themakerd一gest一on;2:圖2:M表示 makerDNAI:提取空載質(zhì)粒2:空載質(zhì)粒F一 9.2EleetroPherogramofdigestedPsiRNA一DUO一GFPzeo ;l:TheextractlonofthePlasmld(PsiRNA一DUO一 GFPzeo)withHlnd111 ThePsiRNA一DUO一GFPzeow一 thHind111digestion2.3重組質(zhì)粒psiRNA一GFP一CTGF和psiRNA一GFP一Tl淤一1的制備2
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2601586