【摘要】：研究背景肝纖維化是常見的病理狀態(tài),是多種原因?qū)е碌穆愿螕p傷所致的病理改變,表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的積聚。肝纖維化是對慢性肝損傷愈合和疤痕形成的應(yīng)答,并且可能進展為肝硬化、肝癌和肝衰竭。然而,迄今在肝纖維化防治方面尚無十分有效的方法,因此有必要對肝纖維化發(fā)生的具體分子機制進一步進行深入研究。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC),又稱貯脂細胞,是肝纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細胞,HSC活化被認為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來,表觀遺傳學(xué)改變對肝纖維化相關(guān)基因表達及HSC活化的影響日益受到重視,其中,miRNAs(micro RNAs)這一表觀遺傳調(diào)控機制在許多生物學(xué)過程和代謝穩(wěn)態(tài)中起重要作用,包括蛋白質(zhì)分泌和脂肪酸代謝等。研究表明,miR-30a、miR-9-5p、miR-142-3p等多種miRNA可以促進或抑制HSC活化。因此,研究miRNA在HSC激活中的作用對抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化有著重要意義。清道夫受體B類I型(scavenger receptor class B type I,SR-BI)是清道夫受體蛋白的B類家族的成員,編碼SR-BI的基因已被命名為清道夫受體B類成員1(scavenger receptor class B member 1,SCARB1)。SR-BI可介導(dǎo)選擇性脂質(zhì)攝取并且在逆向轉(zhuǎn)運膽固醇中起關(guān)鍵作用。SR-BI可受不同核受體和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,包括過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),肝X受體(liver X receptor,LXR),肝受體同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)等,而這些核因子及其相關(guān)分子可通過影響炎癥及脂質(zhì)代謝等參與肝纖維化進程。但SCARB1在肝纖維化進程中的作用機制尚未見報道。本組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-185在肝纖維化患者外周血中上調(diào),可作為診斷肝纖維化的外周血循環(huán)標記物,并且相關(guān)文章已經(jīng)發(fā)表。為進一步研究miR-185促進肝纖維化發(fā)生發(fā)展的具體機制,我們利用生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告實驗篩選并驗證SCARB1為miR-185的靶基因,成功構(gòu)建了干擾SCARB1表達的穩(wěn)定細胞株,并在人肝星狀細胞(LX-2)中證實了miR-185靶向SCARB1影響HSC活化并促進肝纖維化進程,為臨床防治肝纖維化提供一條新的途徑。第一部分:miR-185靶基因的篩選及驗證研究目的:篩選及驗證miR-185的靶基因研究方法:1、通過Targetscan、miRWalk、miRDB等miRNA靶點預(yù)測軟件預(yù)測分析miR-185的靶基因。2、在HEK293工具細胞中對miR-185與SCARB1的靶向關(guān)系檢測:構(gòu)建載有SCARB1的野生型或突變型質(zhì)粒,與miR-185共轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測雙熒光素酶表達的差異,篩選出miR-185的直接作用靶點。3、HSC中miR-185與SCARB1的靶向關(guān)系驗證:用miR-185mimic及miR-185inhibitor轉(zhuǎn)染HSC,利用qRT-PCR方法和Western blot方法檢測上調(diào)或者下調(diào)miR-185后SCARB1表達水平的變化以及肝星狀細胞活化標志物?型膠原(Type?collagen,col?)與α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的變化。研究結(jié)果:1、miRNA靶點預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)SCARB1與miR-185在3’-UTR區(qū)域有結(jié)合位點,可能是miR-185的靶基因。2、靶基因鑒定結(jié)果:共轉(zhuǎn)染SCARB1野生型質(zhì)粒和miR-185過表達質(zhì)粒的細胞中雙螢光素酶比值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明miR-185對SCARB1有直接調(diào)控作用,并抑制其表達。3、HSC中miR-185與SCARB1的靶向關(guān)系驗證結(jié)果:與空白組和陰性對照組相比,HSC中轉(zhuǎn)染miR-185 mimic之后SCARB1的表達量減少,col?和α-SMA的表達量增加,而空白組與陰性對照組相比,SCARB1、col?和α-SMA的表達量無顯著差異;與空白組和陰性對照組相比,HSC中轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor之后SCARB1的表達量增加,col?和α-SMA的表達量減少,而空白組與陰性對照組相比,SCARB1、col?和α-SMA的表達量無顯著差異。結(jié)論:1、生物學(xué)信息預(yù)測SCARB1為miR-185的靶基因。2、熒光素酶報告鑒定SCARB1為miR-185的靶基因。3、上調(diào)miR-185可促進HSC活化,下調(diào)miR-185可抑制HSC活化。第二部分:miR-185靶向SCARB1促使HSC活化的機制研究研究目的:闡明miR-185靶向SCARB1促HSC活化/肝纖維化進程的生物學(xué)機制。研究方法:1、構(gòu)建三個干擾SCARB1表達的穩(wěn)定慢病毒細胞株sh1、sh2、sh3,利用qRT-PCR檢測三個穩(wěn)定株的干擾效率。挑選出干擾效率最高的細胞株進行后續(xù)實驗。2、回復(fù)實驗:利用qRT-PCR、Western blot方法檢測SCARB1干擾穩(wěn)定株組、SCARB1干擾穩(wěn)定株內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor組HSC中SCARB1表達及HSC活化指標col?和α-SMA的表達水平。3、CCK8增殖實驗明確miR-185是否靶向SCARB1影響HSC活化。4、凋亡實驗明確miR-185是否靶向SCARB1影響HSC凋亡。研究結(jié)果:1、穩(wěn)定株篩選結(jié)果:用qRT-PCR方法檢測sh1、sh2、sh3三個不同干擾細胞株中SCARB1的干擾效率。sh1干擾穩(wěn)定細胞株SCARB1的干擾效率最高,因此選為下一步實驗過程中的SCARB1干擾穩(wěn)定細胞株。2、回復(fù)實驗結(jié)果:與空白組和SCARB1干擾對照株組相比,SCARB1干擾穩(wěn)定株組內(nèi)SCARB1的表達明顯下降,col?和α-SMA的表達明顯增加;SCARB1干擾穩(wěn)定株組內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor后,與SCARB1干擾穩(wěn)定株組相比,SCARB1的表達增加,col?和α-SMA下降,進一步驗證了miR-185靶向SCARB1促進HSC活化/肝纖維化的作用。3、CCK8增殖實驗結(jié)果:(1)與空白組和SCARB1干擾對照株組相比,轉(zhuǎn)染SCARB1干擾慢病毒穩(wěn)定株組細胞在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96h顯著增殖。(2)SCARB1干擾穩(wěn)定株組內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor后,與SCARB1干擾穩(wěn)定株組相比,細胞增殖在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96h被抑制,有統(tǒng)計學(xué)差異。4、凋亡實驗結(jié)果:(1)與空白組和SCARB1干擾對照株組相比,轉(zhuǎn)染SCARB1慢病毒干擾穩(wěn)定株48h后細胞凋亡減少,有統(tǒng)計學(xué)差異。(2)SCARB1干擾穩(wěn)定株組內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-185 inhibitor 48h后,與SCARB1干擾穩(wěn)定株組相比,細胞凋亡增加。結(jié)論:1、成功構(gòu)建干擾SCARB1穩(wěn)定表達的細胞株。2、miR-185通過靶向SCARB1促進HSC活化,進而促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。3、干擾SCARB1基因表達可以促進HSC增殖。4、干擾SCARB1基因表達可以抑制HSC凋亡。
【圖文】：

軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文實驗結(jié)果一、miR-185 靶基因的篩選以 miR-185-5p 為檢索詞，在 TargetScan、miRWalk 、miRDB 等數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站分行靶基因預(yù)測分析，然后進一步進行在 Gene ontology(GO)網(wǎng)站進行功能性分析 KEGG 數(shù)據(jù)庫進行代謝通路的 pathway 分析，得到較多與脂質(zhì)代謝相關(guān)的靶基們發(fā)現(xiàn)其中靶基因 SCARB1 是膽固醇代謝通路中的重要基因，，本課題組前期研現(xiàn)多個肝纖維化相關(guān)靶基因與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，因此 SCARB1 可能是 miR-功能靶基因之一。所以我們在數(shù)據(jù)庫中選定了 SCARB1 作為后續(xù)研究。對 SCAR行分析，發(fā)現(xiàn)其與 miR-185 在 3’-UTR 區(qū)域有一個結(jié)合位點（圖 1-1）。

建好的 SCARB1 野生型、突變型的質(zhì)粒分為四組共轉(zhuǎn)染 293T 工具測各組中螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶）的熒光值。實驗共分為四組：實驗組 1 是 SCARB13’UTR-WT+miRNA NC；實驗組 2 是 SCARB13’UTR-WT（SCARB1 野生型）粒；實驗組 3 是 SCARB13’UTR-MUT（SCARB1 突變型）+miRN SCARB13’UTR-MUT（SCARB1 突變型）+miR-185 過表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染了 SCARB13’UTR-WT 質(zhì)粒和 miR-185 NC 的細胞，共轉(zhuǎn)染T 質(zhì)粒和 miR-185 過表達質(zhì)粒的細胞中螢火蟲螢光素酶和海腎螢p<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這項結(jié)果說明：miR-185 對 SCARB并抑制其表達。而共轉(zhuǎn)染了 SCARB1 3’UTR- MUT 質(zhì)粒和 miR-共轉(zhuǎn)染了 SCARB1 3’UTR-MUT 質(zhì)粒和 miR-185 過表達質(zhì)粒的細顯差異，P > 0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。在結(jié)合位點突變后，這種調(diào)控了 miR-185-5p 是通過該結(jié)合位點調(diào)控 luciferase 的表達（圖 1-4）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陳琴;陳連云;金歡歡;張峰;陸茵;鄭仕中;;肝臟樹突狀細胞在肝纖維化中的作用[J];中國藥理學(xué)通報;2015年08期

2 秦愛梅;武彩娥;張希彥;;炎癥介質(zhì)對脂質(zhì)代謝的影響[J];中華老年心腦血管病雜志;2012年09期

3 朱躍科;段鐘平;朱繼東;王寶恩;劉芳;謝賢春;;水飛薊賓卵磷脂復(fù)合物對肝纖維化大鼠肝臟中膠原表達的影響[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2006年12期

本文編號：2601374