【摘要】：目的:觀察雨蛙素刺激對胰腺外分泌細(xì)胞增殖、自噬的影響,探討Sp1/NCX1/Ca~(2+)超載通路和NF-κB/NCX1/Ca~(2+)超載通路在急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)中的作用及其機(jī)制。方法:通過雨蛙素注射大鼠腹腔構(gòu)建AP模型,用生化分析儀測定大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶活性;雨蛙素刺激胰腺腺泡細(xì)胞AR42J,體外誘導(dǎo)細(xì)胞AP模型,采用CCK-8檢測雨蛙素處理后不同時(shí)間(0、24、48、72 h)的細(xì)胞增殖情況。Western blot檢測自噬的經(jīng)典標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅰ和LC3Ⅱ在雨蛙素處理后不同時(shí)間(0、3、6、12、24h)的表達(dá)變化以及Sp1、NF-κB和NCX1在雨蛙素處理后不同時(shí)間(0、1、3、6、12、24 h)蛋白水平的變化。Western blot檢測Sp1抑制劑Mithramycin A和NF-κB抑制劑Bay分別處理AR42J細(xì)胞后檢測NCX1蛋白水平變化。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測Sp1和NF-κB對NCX1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通過激光共聚焦顯微鏡觀察AR42J細(xì)胞中胞漿Ca~(2+)的變化。結(jié)果:在大鼠AP模型中,雨蛙素可上調(diào)血清淀粉酶和脂肪酶的活性(P0.05),促進(jìn)NCX1蛋白水平的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示雨蛙素腹腔注射可誘導(dǎo)胰腺組織中NCX1、Sp1和NF-κB蛋白表達(dá)。在細(xì)胞AP模型中,雨蛙素可抑制AR42J細(xì)胞的增殖(P0.05),且使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,還可上調(diào)AR42J細(xì)胞中NCX1、Sp1和NF-κB蛋白表達(dá)。用Sp1抑制劑M.A或NF-κB抑制劑Bay處理AR42J細(xì)胞均抑制了NCX1蛋白的表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M.A和Bay均可明顯抑制含有NCX1啟動(dòng)子序列的雙熒光素酶載體的活性(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)雨蛙素刺激可使AR42J細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)增加(P0.05)。結(jié)論:Sp1和NF-κB上調(diào)NCX1的表達(dá)在雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中發(fā)揮促進(jìn)作用,并為AP治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1：雨蛙素刺激在體內(nèi)和體外誘導(dǎo) AP 模型。A：血清脂肪酶活性（*P<0.05, n=5）; B：血清淀粉酶活性（***p＜0.001, n=5）; C：CCK8 檢測雨蛙素處理后在不同時(shí)間點(diǎn)（0h, 24h, 48hand 72h）AR42J 細(xì)胞的增殖情況; D：Western blot 檢測雨蛙素刺激 AR42J 細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)（0h, 3h, 6h, 12h and 24h）自噬水平。*p＜ 0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3。Fig1: AP model was induced by caerulein in vivo or in vitro. A and B: Concentrations ofserum lipase and amylase were measured by a biochemical analyzer; C: CCK8 detection of cellproliferation was adopted at 0h, 24h, 48h and 72h after treatment with caerulein. D: LC3II/LC3I, autophagy classic markers, were detected by Western blot at different time points of 0h,3h, 6h, 12h, 24h.. *p＜ 0.05, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3.2.2 雨蛙素誘導(dǎo)的 AP 模型中 NCX1 表達(dá)上調(diào)。為了研究NCX1在AP模型中的表達(dá)及可能的功能，我們首先通過Western blot檢測大鼠 AP 模型中 NCX1 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表示，和陰性對照組比較，，大鼠

圖 2：NCX1 在雨蛙素誘導(dǎo)的 AP 模型中上調(diào)。A：雨蛙素誘導(dǎo)大鼠 AP 模型，Western Blot檢測與對照組比較，NCX1 的表達(dá)變化情況（*P<0.05, n=4）。B：免疫組織化學(xué)染色方法檢測大鼠 AP 模型中對照組和雨蛙素組胰腺組織中 NCX1 的表達(dá)情況。C：雨蛙素誘導(dǎo)細(xì)胞 AP模型，Western Blot 檢測不同時(shí)間點(diǎn)（0，1，3，6，12 and 24 h）NCX1 的表達(dá)變化情況（*P<0.05,n=3）。在雨蛙素構(gòu)建的大鼠和細(xì)胞 AP 模型中，NCX1 的表達(dá)均明顯上調(diào)。Fig 2: NCX1 was upregulated in cerulein-induced AP models.A: Western blot was used todetect the expression of NCX1 in ratAP model induced by cerulein(*P<0.05, n=4). B: NCX1protein was measured by immunohistochemical staining. C: NCX1 was detected by Westernblot and PCR in cellAP model at different time points of 0, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h（*P<0.05, n=3）.2.3 NCX1 上調(diào)介導(dǎo)鈣超載為了驗(yàn)證 AR42J 細(xì)胞對雨蛙素處理是否引起[Ca2+]cyt升高，并且 NCX1 是否參與了該過程，我們設(shè)計(jì)了鈣測定實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞外 0Na+的環(huán)境下，由于細(xì)胞內(nèi)外濃
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R576

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊淑麗;劉潔;陳衛(wèi)昌;;自噬在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用[J];臨床肝膽病雜志;2014年08期

本文編號：2600115