【摘要】：目的 ①在體外建立共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)運。②胎盤細胞凋亡在感染HBV的PBMCs轉(zhuǎn)運中作用。 方法 ①本次實驗采用100μl HBV DNA含量為5×10~6copies/ml的病人血清感染PBMC,用CCK-8試劑盒檢測不同共培養(yǎng)時間點12h、24h、48h和72h細胞的生長狀況。將共培養(yǎng)的細胞清洗4次，用FQ-PCR法檢測PBMC和洗液中的HBV DNA的含量。 ②在1μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細胞技術(shù)（FACS）檢測Transwell小室上室感染HBV的PBMC與BeWo的融合現(xiàn)象。以8μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細胞技術(shù)（FACS）檢測下室中是否出現(xiàn)標有綠色熒光的PBMC。 ③本次實驗將共培養(yǎng)模型設立三個組：正常對照組、HBV與BeWo共培養(yǎng)組、HBV~+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h后分別收集各組細胞通過FACS檢測細胞的凋亡情況。 ④用RT-PCR法檢測HBV~+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同時間點0h、12h、24h、48h，BeWo細胞的Caspase3 mRNA的表達情況。 ⑤用FQ-PCR法檢測HBV~+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組下室中的PBMC的HBV DNA和HBVcccDNA含量。 結(jié)果 ①5×10~6copies/ml的HBV陽性血清刺激PBMC，共培養(yǎng)12h、24h和48hPBMC的細胞數(shù)不斷增加，共培養(yǎng)72h左右，細胞數(shù)會減少。與HBV血清共培養(yǎng)48h的PBMC檢測出HBVDNA，提示發(fā)生感染，而清洗細胞的洗液中未檢測出HBV DNA。 ②在1μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng)模型中BeWo細胞被染上了綠色熒光提示HBV~+PBMC與BeWo發(fā)生了融合。以8μm孔徑的Transwell小室進行實驗，下室中檢測到標有綠色熒光的PBMC，證明在Transwell小室共培養(yǎng)感染HBV的PBMC與BeWo細胞模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)模型構(gòu)建成功。 ③BeWo與HBV血清和HBV~+PBMC共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h，HBV感染組和HBV~+PBMC共培養(yǎng)組的早期凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F值分別為0.027、1.824、7.186、7.749，P值均大于0.05）。在共培養(yǎng)0h、12h，HBV感染組和HBV~+PBMC共培養(yǎng)組，BeWo總凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F值分別為2.922、1.356，P值均大于0.05）；但是共培養(yǎng)24h、48h，HBV感染組總凋亡率與同期的對照組和HBV~+PBMC共培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為15.678、14.892，P值均小于0.05）。分別對同一組內(nèi)不同時間點的早期凋亡率及總凋亡率進行比較，各組中不同時間點的凋亡率不同，隨著共培養(yǎng)時間的延長，凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢，到48h時HBV感染組總凋亡率為（68.90±0.33）%達到最高。不同時間點早期凋亡率的比較，除了對照組其它各組的差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為3.968、31.648、31.941，對照組P值大于0.05，其他各組P值均小于0.05），且不同時間點總凋亡率的差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為82.827、29.292、63.951，P值均小于0.05）。 ④HBV~+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同的時間點BeWo細胞Caspase3 mRNA的表達量相比較差別有統(tǒng)計學意義（F=38.114,P=0.002），且各組間兩兩比較后，除12h與0h外，Caspase3mRNA的相對表達量相比無差異外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義。在24h和48h組中，隨著時間的延長Caspase3 mRNA的相對表達量有升高的趨勢。 ⑤在BeWo細胞和HBV~+PBMC共培養(yǎng)組中，BeWo細胞早期凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.908，p=0.002)，BeWo細胞總凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.969，p=0.001)。BeWo細胞Caspase3 mRNA相對表達量和PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.950，p=0.001）。 ⑥HBV~+PBMC與BeWo細胞共培養(yǎng)24h和48h時，下室的PBMC HBV DNA拷貝數(shù)分別為(1.925±0.431)×10~3copies/ml、(2.565±0.361)×10~3copies/ml，，同時，在此時間點HBV cccDNA的拷貝數(shù)分別為(7.560±1.513)×10~2copies/ml、(1.3550±2.473)×10~3copies/ml，按判斷標準HBV DNA拷貝數(shù)≥103copies/ml為陽性，提示此時間點下室中的PBMC發(fā)生感染，且按判斷標準HBV cccDNA拷貝數(shù)≥5×10~2copies/ml為陽性，提示HBV發(fā)生復制。 結(jié)論 ①乙型肝炎病毒能夠在PBMC中復制，并在體外成功構(gòu)建BeWo細胞與感染HBV的PBMC共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)運。 ②胎盤細胞凋亡率與PBMC的遷移率的正相關(guān)關(guān)系，提示凋亡可能與感染HBV的PBMC的轉(zhuǎn)運有關(guān)。 ③上室中感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運至下室后，可感染下室的PBMC�？赏普撊舾腥綡BV的母親PBMC轉(zhuǎn)運至胎兒血循環(huán)會造成胎兒PBMC HBV感染。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 白菡;何麗霞;馬力;李穎;趙桂珍;;人早孕胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細胞體外培養(yǎng)模型的建立[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2006年03期

2 陳莉娟;周浩;朱劍文;鄒麗;;改良的高純度人早孕絨毛膜滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)方法[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2008年03期

3 楊小梅;甘濤;劉志華;張娜;;分娩方式及HBV-DNA載量對乙型肝炎母嬰傳播阻斷效果的影響[J];海南醫(yī)學;2011年01期

4 龔洵;喬福元;劉海意;王少帥;;人早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞的體外分離與培養(yǎng)[J];華中醫(yī)學雜志;2007年06期

5 李榮皓,莊臨之;人胎盤的生殖內(nèi)分泌學研究——Ⅰ.人細胞滋養(yǎng)層細胞的無血清培養(yǎng)與生長因子的作用[J];中國科學(B輯 化學 生命科學 地學);1990年09期

6 程勇前,聶青和,周永興,杜德偉,楊華光;人胎盤滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng)及IgG FcγRⅢ在滋養(yǎng)層細胞的表達[J];醫(yī)學研究生學報;2002年02期

7 鄭偉,石一復;人胎盤滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)與體外hCG釋放的研究[J];細胞生物學雜志;1996年04期

8 白菡;張琳;何麗霞;馮國和;石理蘭;竇曉光;趙桂珍;;胎盤滋養(yǎng)層細胞的感染和凋亡與HBV的宮內(nèi)傳播機制[J];世界華人消化雜志;2007年15期

9 劉明慧;魏俊妮;郭珍;楊佳;張s

本文編號：2599737