【摘要】： 研究背景: 肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)凋亡是肝纖維化逆轉(zhuǎn)的重要機(jī)制,而肝細(xì)胞凋亡是肝纖維化形成的重要促進(jìn)因素,因此尋找選擇性誘導(dǎo)HSCs凋亡的治療途徑對于抗肝纖維化具有非常重要的意義。柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)從20世紀(jì)40年代由5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)和磺胺吡啶(sulfapyridine,SPY)通過偶氮鍵合成了SASP,主要用于治療潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病。已有研究表明,柳氮磺胺吡啶可選擇性誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制尚不清楚。它對肝星狀細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的凋亡有無影響報(bào)道甚少。我們以柳氮磺胺吡啶為誘導(dǎo)劑,觀察柳氮磺胺吡啶及其分解產(chǎn)物5-氨基水楊酸和磺胺吡啶在體外對正常人肝細(xì)胞株(L02細(xì)胞)和大鼠肝星形細(xì)胞株(HSC-T6細(xì)胞)增殖和凋亡的影響,確定其有效的藥物成分,并探討其可能的機(jī)制。 方法: 1、最佳藥物濃度與作用時間的篩選: 實(shí)驗(yàn)分組:柳氮磺胺吡啶作用濃度:0.125、0.25、0.5、1、 2、4、8、16mmol/L;作用時間:12、24和48小時。 實(shí)驗(yàn)方法:CCK-8法檢測不同濃度的柳氮磺胺吡啶在不同時間點(diǎn)對HSC-T6增殖的影響。 2、柳氮磺胺吡啶對HSC-T6和L02增殖和凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)分組:正常對照組;0.1% DMSO對照組;柳氮磺胺吡啶處理組(0.5、1、2 mmol/L)。 實(shí)驗(yàn)方法:CCK-8法檢測柳氮磺胺吡啶對HSC-T6和L02增殖的影響;ANNEXINⅤ-FITC/PI雙染觀察柳氮磺胺吡啶對HSC-T6和L02凋亡的影響;AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。 3、誘導(dǎo)HSC-T6凋亡的有效藥物成分分析 實(shí)驗(yàn)分組:正常對照組;0.1%DMSO對照組;柳氮磺胺吡啶處理組(0.5、1、2mmol/L);5-氨基水楊酸處理組(0.5、1、2mmol/L);磺胺吡啶處理組(0.5、1、2mmol/L);5-氨基水楊酸(2mmol/L)+磺胺吡啶(2mmol/L)處理組。 實(shí)驗(yàn)方法:采用CCK-8法檢測各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6增殖情況;ANNEXINⅤFITC/PI雙染檢測各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6凋亡情況。 4、柳氮磺胺吡啶選擇性誘導(dǎo)HSC-T6凋亡的機(jī)制 4.1、柳氮磺胺吡啶及其分解產(chǎn)物對IKKα和IκBα磷酸化的影響 實(shí)驗(yàn)分組:正常對照組;TNF-α處理組(150U/ml);DMSO+TNF-α處理組;TNF-α+柳氮磺胺吡啶處理組(0.5、1、2mmol/L);TNF-α+5-氨基水楊酸處理組(2mmol/L);TNF-α+磺胺吡啶處理組(2mmol/L)。 實(shí)驗(yàn)方法:Western Blot檢測磷酸化IKKα和磷酸化IκBα的表達(dá)。 4.2、柳氮磺胺吡啶及其分解產(chǎn)物對NF-?B核轉(zhuǎn)位的影響 實(shí)驗(yàn)分組:正常對照組;TNF-α處理組(150U/ml);DMSO+TNF-α處理組;TNF-α+柳氮磺胺吡啶處理組(2mmol/L);TNF-α+5-氨基水楊酸處理組(2mmol/L);TNF-α+磺胺吡啶處理組(2mmol/L)。 實(shí)驗(yàn)方法:采用NF-?B分子標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡觀察NF-?B核轉(zhuǎn)位抑制情況;Western Blot檢測細(xì)胞核NF-?B P65的表達(dá)。 結(jié)果: 1、與對照組比較,在一定濃度范圍(0.5、1、2、4、8、16mmol/L)內(nèi),柳氮磺胺吡啶對HSC的增殖呈劑量、時間依賴性抑制。柳氮磺胺吡啶在12、24、48小時抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的50%抑制濃度(IC50)分別為6.53、2.84、1.5mmol/L。結(jié)合文獻(xiàn),我們?nèi)〗咏?4h的1/3～2/3的IC50濃度(0.5、1、2mmol/L)進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。 2、正常對照組和DMSO對照組的凋亡率分別為1.74±0.31%,3.42±0.41%;柳氮磺胺吡啶(0.5、1、2mmol/L)處理24小時后HSC-T6的凋亡率依次為6.96±0.39%、12.09±1.56%和16.72±2.98%,呈明顯的時間和劑量效應(yīng),同時伴有晚期凋亡細(xì)胞增加。AO/EB染色后,出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的特征性改變。 3、柳氮磺胺吡啶(0.5、1、2 mmol/L)處理L02 24小時后對L02的增殖抑制率和凋亡率與正常對照組和DMSO對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);AO/EB染色后,未觀察到凋亡細(xì)胞。 4、5-氨基水楊酸和磺胺吡啶(0.5、1、2 mmol/L)處理HSC-T6 24小時后,HSC-T6的增殖抑制率和凋亡率與正常對照組和DMSO對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 5、柳氮磺胺吡啶處理組(0.5、1、2mmol/L)磷酸化IKKα、I?Bα較DMSO+TNF-α處理組逐漸減弱;而5-氨基水楊酸(2mmol/L)和磺胺吡啶(2mmol/L)處理組磷酸化IKKα、I?Bα與DMSO+TNF-α處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 6、柳氮磺胺吡啶處理組(2mmol/L)細(xì)胞核NF-?B P65的表達(dá)較TNF-α處理組明顯減弱;而5-氨基水楊酸(2 mmol/L)和磺胺吡啶(2mmol/L)處理組細(xì)胞核NF-?B P65的表達(dá)與TNF-α處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 7、正常對照組NF-κB P65主要在細(xì)胞漿表達(dá),少量在胞核表達(dá),TNF-α處理組NF-κB P65幾乎都在細(xì)胞核表達(dá),柳氮磺胺吡啶組NF-κB P65細(xì)胞核幾乎不表達(dá);柳氮磺胺吡啶+TNF-α處理組較TNF-α處理組NF-κB P65細(xì)胞核表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論: 1、柳氮磺胺吡啶能夠選擇性抑制肝星狀細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡;其分解產(chǎn)物5-氨基水楊酸和磺胺吡啶對肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡無明顯影響。 2、柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)HSC-T6凋亡的同時伴有磷酸化IKKα、磷酸化IκBα蛋白以及胞核內(nèi)NF-κB P65蛋白表達(dá)的減少,提示柳氮磺胺吡啶可能通過抑制Rel/NF-?B/I?B/IKK信號通路誘導(dǎo)HSCs凋亡。
【圖文】：

附圖 1-ⅠA 正常對照組 12 hFigure 1-ⅠA normal control group 12h附圖 1-ⅠB DMSO 對照組 12 hFigure 1-ⅠB DMSO treated group 12 h附圖 1-ⅠC 0.5mmol/L SASP 處理組 12 hFigure 1- Ⅰ C 0.5mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附圖 1-ⅠD 1mmol/L SASP 處理組 12 hFigure 1- Ⅰ D 1mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h

附圖 1-ⅠC 0.5mmol/L SASP 處理組 12 hFigure 1- Ⅰ C 0.5mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附圖 1-ⅠD 1mmol/L SASP 處理組 12 hFigure 1- Ⅰ D 1mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附圖 1-ⅠE 2mmol/L SASP 處理組 12 hFigure 1-ⅠE 2mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附圖 1-Ⅰ Annexin V-FITC 流式細(xì)胞儀檢測 SASP 對 HSC-T6 凋亡的影響(12 小時)Figure 1-ⅠApoptotic rate of HSC-T6 which were treated with sulfasalazine for 12 hoursby FCM with Annexin V-FITC
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Effect of caffeic acid phenethyl ester on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2003年06期

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本文編號：2599707