【摘要】： 目的:醫(yī)學(xué)界對(duì)食管下括約肌(lower esophageal sphincter, LES)是否存在及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的探討經(jīng)歷了一個(gè)很長(zhǎng)的發(fā)展過程。直到1979年,Liebermann-Meffert等學(xué)者通過對(duì)32例尸體標(biāo)本的解剖研究,詳細(xì)闡述了食管胃連接部(esophagogastric junction, EGJ)平滑肌束的宏觀排列,提出人類LES的肌肉系統(tǒng)由套索纖維(sling fibers)和鉤狀纖維(clasp fibers)共同構(gòu)成。鉤狀纖維位于LES右側(cè),呈半環(huán)形,套索纖維是一組不完整的U形肌束懸掛于胃食管交界部,食管下端的左側(cè),His角上方。它的開口側(cè)位于胃小彎,閉口側(cè)位于胃大彎。這兩束肌肉共同維持LES的關(guān)閉狀態(tài),并形成了LES高壓帶(high-pressure zone, HPZ,15~30mmHg)。這一理論為進(jìn)一步研究LES的生理、病理和藥理學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。隨后學(xué)者們主要對(duì)不同動(dòng)物L(fēng)ES的生理學(xué)特點(diǎn)和功能調(diào)節(jié)進(jìn)行了較為深入的探討,發(fā)現(xiàn)LES具有明顯不同于其它平滑肌結(jié)構(gòu)的特性。而且更為重要的是,構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維在諸多方面也存在著很大的差異性。因此,LES結(jié)構(gòu)或功能狀態(tài)的異常是多種食管疾病的病理基礎(chǔ)。 現(xiàn)在一般認(rèn)為,平滑肌細(xì)胞胞漿游離Ca~(2+)在平滑肌收縮過程中起重要的“第二信使”作用。平滑肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)依賴胞漿中Ca~(2+)的濃度,高濃度Ca~(2+)引起平滑肌收縮,低濃度Ca~(2+)引起平滑肌舒張。平滑肌收縮時(shí)的Ca~(2+)來源于細(xì)胞外液Ca~(2+)內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫Ca~(2+)釋放(主要是肌質(zhì)網(wǎng),SR)。胞外Ca~(2+)可通過質(zhì)膜鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞;胞內(nèi)Ca~(2+)的釋放也通過鈣離子通道。鈣離子通道存在于所有可興奮細(xì)胞以及一些非興奮細(xì)胞乃至原核生物。同骨骼肌、心肌類似,鈣通道對(duì)內(nèi)臟平滑肌細(xì)胞的舒縮起著舉足輕重的作用。而平滑肌細(xì)胞膜L型鈣通道在平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)中起重要作用,當(dāng)平滑肌細(xì)胞膜去極化時(shí),通過L型鈣通道流入細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)是平滑肌細(xì)胞收縮的觸發(fā)因素。 本研究應(yīng)用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(patch clamp technique)對(duì)人類LES平滑肌細(xì)胞膜上鈣離子通道的類型及常見的影響因素進(jìn)行分析,并深入探討構(gòu)成LES的套索纖維和鉤狀纖維可能具有的不同生物學(xué)特征及其內(nèi)在機(jī)制�？梢栽O(shè)想,對(duì)LES的深入研究將大大有助于對(duì)賁門失弛癥、食管下括約肌高壓癥等食管運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病,以及胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)等食管良性疾病病因和病理學(xué)的理解以及治療方法的選擇。 方法:選取2007年1月至2007年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者22例,其中男性13例,女性9例,平均年齡57.3歲。手術(shù)室采集新鮮手術(shù)標(biāo)本,銳性剝?nèi)ノ纲S門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后,制備套索纖維、鉤狀纖維的肌條,將肌條剪成2mm~3的小塊,用含膠原酶Ⅱ和木瓜酶的細(xì)胞分離液分離出單個(gè)平滑肌細(xì)胞。確認(rèn)分離細(xì)胞活性在95%以上。然后用37℃Hepes緩沖液懸浮備用。 細(xì)胞存活率測(cè)定:取5滴細(xì)胞懸浮液,加1滴0.2%的臺(tái)盼藍(lán)溶液,混勻3 min內(nèi)計(jì)數(shù),當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)將被染成紅色,活細(xì)胞無色。用以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率(%)=活性細(xì)胞總數(shù)P/(活性細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100 %。 將細(xì)胞灌流槽固定于倒置顯微鏡的工作臺(tái)上,吸取急性分離的平滑肌細(xì)胞懸液數(shù)滴于灌流槽中,待細(xì)胞貼壁后,用鈣電流相應(yīng)的灌流液灌流,選取表面光潔、邊緣整齊,光滑的,靜止不動(dòng),立體感強(qiáng)的細(xì)胞為研究對(duì)象。記錄電極由硬質(zhì)玻璃毛坯經(jīng)水平拉制儀(Sutter P-97, USA)四步拉制而成,內(nèi)充鈣離子電極內(nèi)液后阻抗為2~3MΩ。采用三維液壓微操縱器將電極靠近細(xì)胞進(jìn)行封接,負(fù)壓吸引致封接阻抗達(dá)1GΩ以上,吸破細(xì)胞膜,補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻,形成全細(xì)胞記錄模式。脈沖信號(hào)由pulse+ pulsefit軟件(HEKA, version 8.53,法耳次,德國)控制,通道信號(hào)經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器(HEKA,法耳次,德國)放大,通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞,產(chǎn)生的電流信號(hào)經(jīng)EPC-9轉(zhuǎn)換,為pulse+ pulsefit軟件收集、分析,收集到的數(shù)據(jù)采用Origin 7.5擬合。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(25oC)下進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,通過軟件SPSS 13.0 (SPSS公司,芝加哥,美國)完成。以P0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。 結(jié)果: 1單個(gè)LES細(xì)胞的形狀 在倒置顯微鏡下,新鮮分離的食管下括約肌套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞呈梭形,長(zhǎng)短不一。在Hepes緩沖液中,部分平滑肌細(xì)胞完全舒張,部分處于不同程度的收縮狀態(tài),二者均有一個(gè)中心核(Fig. 2~3)。套索纖維細(xì)胞平均長(zhǎng)度為101.1±27.2μm (51~148μm,n=200);鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度為99.5±23.6μm(48～146μm,n=200)。二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05(t=0.247, P=0.676)。 2 I-V曲線 將細(xì)胞鉗制在-60mV或-90mV,以10mV的階躍刺激細(xì)胞去極化從-80~+30mV,波寬為200ms。可記錄到一內(nèi)向電流,在刺激開始后5~13ms時(shí)出現(xiàn),在I-V曲線中0mV達(dá)到峰值,在約-50mV處翻轉(zhuǎn)。兩者的IV曲線均呈U型,只不過峰值不同,在鉗制電位為-60mV時(shí)為-5.58±1.53pA/Pf (n=6 cells),顯著低于鉗制電位為-90mV的內(nèi)向電流-7.02±0.93pA/pF (n=6 cells),P0.05(t=1.970, P=0.043)。并且套索纖維及鉤狀纖維平滑肌細(xì)胞的記錄電流未發(fā)現(xiàn)不同。 3 Nifedipine對(duì)內(nèi)向電流的影響 Nifedipine可顯著抑制內(nèi)向電流,鉗制電壓為-60mV和-90mV時(shí),10μm Nifedipine幾乎可完全取消內(nèi)向電流(-0.44±0.73pA/pF-1.47±1.23 pA/pF,n=6 cells)。和正常電流相比P0.05(t=7.427, P=0.000t=8.816, P=0.000)。在0.1、1、5μm時(shí)也發(fā)現(xiàn)相同的趨勢(shì)。 結(jié)論: 1.套索纖維和鉤狀纖維肌細(xì)胞形態(tài)類似,長(zhǎng)度相當(dāng)。 2.人LES的內(nèi)向電流主要通過L型鈣通道,沒證據(jù)表明除L型鈣通道之外其他類型的鈣通道存在。 3. Nifedipine可顯著抑制內(nèi)向電流,而L型鈣通道的特征之一就是對(duì)二氫吡啶類藥物如Nifedipine的高敏感性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R571

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王進(jìn),高天禮;心肌細(xì)胞的鈣致鈣釋放[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1997年02期

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本文編號(hào)：2598748