【摘要】：研究背景及目的非酒精脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)為慢性代謝性疾病,主要病理特征為肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)沉積及空泡變性。在我國,NAFLD已經(jīng)超越慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病,嚴(yán)重影響國民健康。隨著肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積加重及炎癥反應(yīng)發(fā)生,約20%NAFLD患者可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。其中,部分 NASH 患者逐漸發(fā)展為肝細(xì)胞纖維化,甚至肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前公認(rèn)的主流學(xué)說為多重打擊學(xué)說:在NAFLD早期肝細(xì)胞開始出現(xiàn)脂質(zhì)沉積;隨著脂質(zhì)沉積增加肝細(xì)胞脂毒性破壞加重,繼而誘發(fā)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞線粒體受損、大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生并觸發(fā)多種炎癥因子釋放并加劇肝細(xì)胞損傷。眾多文獻(xiàn)證實(shí),ROS及由其觸發(fā)的炎性反應(yīng)是促進(jìn)NASH進(jìn)展的主要因素之一。因此,尋找靶向干預(yù)ROS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子,對于NASH臨床治療具有重要意義。肝臟內(nèi)富含多種固有免疫細(xì)胞,固有免疫細(xì)胞及相關(guān)分子參與多種肝臟疾病致病過程。越來越多的研究表明,固有免疫細(xì)胞尤其是肝臟巨噬細(xì)胞在NASH疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有報(bào)道稱,NASH肝內(nèi)往往伴有肝巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞,kuppfercell,KC)的浸潤及炎性活化。KCs活化后可產(chǎn)生多種介質(zhì),如ROS和促炎細(xì)胞因子等,加劇NASH所誘導(dǎo)的肝損傷。BaeckC等證實(shí),靶向干預(yù)趨化因子MCP-1,可有效抑制肝巨噬細(xì)胞浸潤,減輕膽堿-蛋氨酸缺乏飲食(methionine-choline deficient diet,MCD)誘導(dǎo)的 NASH 小鼠肝損傷。所以,靶向肝臟巨噬細(xì)胞,尤其是肝巨噬細(xì)胞來源的ROS及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),有望為NASH治療提供新策略。Tim-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3)最初被定義為T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)分子。但越來越多的證據(jù)表明,多種固有免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均表達(dá)Tim-3。單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均組成性表達(dá)高水平的Tim-3,不同環(huán)境因素調(diào)節(jié)Tim-3表達(dá),進(jìn)而影響單核/巨噬細(xì)胞功能,參與多種疾病進(jìn)展。腫瘤微環(huán)境中的TGFβ促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá),升高的Tim-3參與影響巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。另有研究稱,慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)患者外周Tim-3+CD14+單核細(xì)胞數(shù)目與患者血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)呈正相關(guān)。然而,Tim-3是否通過調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞功能參與NASH進(jìn)展,迄今尚無文獻(xiàn)報(bào)道。在NASH誘導(dǎo)的肝損傷過程中,Tim-3對巨噬細(xì)胞活化及活性氧產(chǎn)生是否具有調(diào)控作用,仍有待證實(shí)。本研究擬利用MCD建立NASH小鼠模型,探討Tim-3對肝巨噬細(xì)胞的調(diào)控及其在NASH中的作用。方法與結(jié)果1.NASH小鼠肝組織Tim-3表達(dá)顯著升高,敲除Tim-3明顯促進(jìn)NASH進(jìn)展為探討Tim-3在NASH中作用及可能的機(jī)制,我們首先利用MCD飼料、高脂飼料(High-Fat Diet,HFD)飼喂C57BL/6小鼠建立NASH小鼠模型。收集MCD飲食2W、HFD飲食24W小鼠肝組織,采用免疫組化及western blot分析肝內(nèi)蛋白水平的Tim-3表達(dá)。結(jié)果表明,與正常飲食(normal diet,ND)組相比較,MCD及HFD誘導(dǎo)的NASH小鼠肝組織中Tim-3表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增加,提示Tim-3可能參與影響NASH。為進(jìn)一步明確Tim-3在NASH誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,利用TALEN技術(shù)構(gòu)建Tim-3敲除(Tim-3KO)小鼠。分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞,利用流式分析肝內(nèi)CD45+細(xì)胞Tim-3表達(dá),證實(shí)肝內(nèi)免疫細(xì)胞來源的Tim-3敲除成功。分別對野生型(wild type,WT)及Tim-3KO小鼠進(jìn)行MCD飲食,誘導(dǎo)NASH模型,比較兩組小鼠肝臟損傷及脂質(zhì)沉積情況。結(jié)果表明,與WT小鼠相比較:Tim-3KO小鼠MCD處理后血清ALT顯著上調(diào),肝組織甘油三酯(Triglyceride,TG)增加,肝細(xì)胞空泡化加劇,肝組織纖維化明顯加重。以上結(jié)果證實(shí),Tim-3減緩MCD誘導(dǎo)的NASH小鼠的肝臟炎性損傷。2.Tim-3在NASH小鼠肝內(nèi)不同巨噬細(xì)胞亞群的表達(dá)均顯著增加肝臟內(nèi)的主要固有免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、NK及NKT等,均表達(dá)較高水平的Tim-3,上述免疫細(xì)胞在NASH進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。為明確NASH小鼠肝內(nèi)高水平Tim-3的主要固有免疫細(xì)胞來源,本實(shí)驗(yàn)收集MCD處理2W小鼠肝組織,首先采用40%percol對肝單個(gè)核進(jìn)行體外分離,然后利用流式細(xì)胞術(shù)分析肝內(nèi)巨噬細(xì)胞、NK及NKT細(xì)胞的比例。流式結(jié)果表明,MCD誘導(dǎo)的NASH模型肝臟內(nèi)NKT比例顯著降低,而NK及巨噬細(xì)胞比例顯著升高。進(jìn)一步對比兩組小鼠肝內(nèi)NK及巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)相比較ND組,MCD肝內(nèi)NK細(xì)胞Tim-3無顯著變化,而肝臟貼壁巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)。肝巨噬細(xì)胞為異質(zhì)性細(xì)胞群,包括F4/80+CD11b+、F4/80+CD68+、F4/80+CD169+等巨噬細(xì)胞亞群。流式結(jié)果表明,MCD誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟內(nèi)上述三群巨噬細(xì)胞亞群中的Tim-3表達(dá)均見顯著上調(diào)。上述流式結(jié)果在HFD小鼠模型中也得到了進(jìn)一步驗(yàn)證,HFD 24W小鼠肝內(nèi)F4/80+CD11b+以及F4/80+CD68+巨噬細(xì)胞中Tim-3表達(dá)顯著升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證人發(fā)生脂肪變的肝組織中巨噬細(xì)胞Tim-3是否高表達(dá),收集肝癌患者癌旁組織,免疫熒光技術(shù)檢測CD68+細(xì)胞Tim-3表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比較,發(fā)生空泡化(提示可能發(fā)生肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積)肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)明顯升高。綜上,Tim-3在NASH動物模型肝臟不同巨噬細(xì)胞亞群及人發(fā)生空泡化的肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)均見顯著增加,提示肝巨噬細(xì)胞為NASH肝內(nèi)高水平Tim-3的主要細(xì)胞來源,在NASH中發(fā)揮作用。3.MCD肝勻漿及OA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Tim-3高表達(dá)為明確NASH小鼠肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平Tim-3的原因,尋找誘導(dǎo)Tim-3升高的組織微環(huán)境因素,制備ND及MCD飲食2周小鼠肝勻漿并分別刺激腹腔來源的巨噬細(xì)胞,體外模擬NASH肝臟內(nèi)微環(huán)境對巨噬細(xì)胞刺激作用。qPCR結(jié)果顯示,與ND肝勻漿刺激組相比較,MCD肝勻漿刺激后巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著上調(diào)。與此相一致,不飽和脂肪酸油酸(oil acid,OA)刺激巨噬細(xì)胞,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)沉積,并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)升高。上述結(jié)果提示OA及NASH小鼠肝臟微環(huán)境促進(jìn)巨噬細(xì)胞Tim-3高表達(dá)。4.Tim-3明顯抑制巨噬細(xì)胞ROS及下游炎性因子產(chǎn)生肝臟巨噬細(xì)胞來源的ROS在NASH中發(fā)揮重要作用,為研究Tim-3對巨噬細(xì)胞來源ROS的具體作用,本實(shí)驗(yàn)分別收集MCD、HFD小鼠肝臟貼壁巨噬細(xì)胞,流式檢測其ROS水平,并比較WT及Tim-3KO小鼠肝組織中NADPH酶2(NOX2)的表達(dá)差異。與前期報(bào)道一致,MCD、HFD小鼠肝貼壁巨噬細(xì)胞ROS水平顯著高于ND組,說明巨噬細(xì)胞來源ROS在NASH中具有重要作用。進(jìn)一步收集MCD飲食2周的WT、Tim-3KO小鼠肝組織,western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,Tim-3KO小鼠肝組織NOX2表達(dá)顯著增加,提示Tim-3對ROS發(fā)揮調(diào)控作用。為證實(shí)以上推論,利用Tim-3中和抗體(anti-Tim-3)阻斷骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)Tim-3 通路后進(jìn)行體外刺激,流式檢測ROS水平。結(jié)果表明,LPS、PA刺激經(jīng)anti-Tim-3預(yù)處理的BMDM后ROS水平較IgG組顯著升高。上述趨勢在siTim-3預(yù)處理的腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophage,PM)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。進(jìn)一步利用Tim-3KO來源的BMDM及PM,同樣觀察到Tim-3對巨噬細(xì)胞ROS及線粒體活性氧的抑制作用。此外,相比較WT對照組,Tim-3KO小鼠來源的肝臟貼壁巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生也明顯增加。以上研究結(jié)果說明:Tim-3抑制巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生。有文獻(xiàn)稱,ROS可誘導(dǎo)炎性小體活化及相關(guān)炎性因子產(chǎn)生。為研究Tim-3是否調(diào)控ROS介導(dǎo)的炎性小體活化及下游炎性分子分泌,我們對MCD處理后WT及Tim-3KO小鼠肝內(nèi)炎性小體活化及下游相關(guān)分子表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與MCD處理的WT小鼠相比較,MCD飼喂的Tim-3KO小鼠肝內(nèi)caspase-1 p20、IL-1β、IL-18表達(dá)均呈顯著升高,但TNF-a表達(dá)無顯著差異。同樣,Western blot、RT-PCR 及 ELISA 結(jié)果表明,anti-Tim-3 預(yù)處理的 BMDM 中 caspase-1 p20表達(dá)升高、IL-1β分泌增加,提示Tim-3抑制巨噬細(xì)胞炎性小體活化及相關(guān)炎性因子產(chǎn)生。進(jìn)一步利用ROS抑制劑NAC(N-acetylcysteine,NAC)預(yù)處理WT、Tim-3KO小鼠來源PM,流式結(jié)果顯示:NAC處理后Tim-3KO對IL-1β的上調(diào)作用消失。綜上結(jié)果提示,Tim-3通過負(fù)向調(diào)控ROS抑制巨噬細(xì)胞炎性小體活化及相關(guān)炎性因子釋放。5.ROS抑制劑顯著減緩Tim-3KO小鼠中MCD介導(dǎo)的肝損傷為進(jìn)一步明確Tim-3抑制ROS在MCD介導(dǎo)肝損傷中的作用,設(shè)計(jì)NAC體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。分別給予WT及Tim-3KO小鼠150mg/kgNAC隔日腹腔注射處理,MCD飲食飼喂2周后:采集外周血分離血清檢測ALT;制備肝勻漿檢測TG、IL-1β以及IL-18水平;肝組織提取蛋白檢測caspase-1p20;肝石蠟切片后進(jìn)行HE染色觀察肝細(xì)胞空泡化。結(jié)果顯示,NAC及MCD處理后WT與Tim-3KO小鼠上述指標(biāo)均無顯著差異,提示NAC處理可以顯著改善Tim-3KO導(dǎo)致的NASH肝損傷。結(jié)論:NASH肝臟微環(huán)境促進(jìn)肝內(nèi)多種巨噬細(xì)胞亞群高表達(dá)Tim-3,Tim-3顯著抑制巨噬細(xì)胞ROS及下游炎性因子分泌,保護(hù)NASH引起的肝損傷。創(chuàng)新性和意義:本研究首次報(bào)道了 NASH個(gè)體中肝臟不同巨噬細(xì)胞顯著高表達(dá)Tim-3,發(fā)現(xiàn)Tim-3抑制巨噬細(xì)胞ROS及其下游炎性反應(yīng),發(fā)揮減緩非酒精性脂肪肝介導(dǎo)肝損傷的作用。上述研究結(jié)果不僅有助于闡明免疫檢查點(diǎn)Tim-3在NASH肝固有免疫中的作用,并且為NASH治療提供了新靶點(diǎn)。
【圖文】：

與ＮＤ組相比較，ＭＣＤ及ＨＦＤ處理后：ＮＡＳＨ小鼠血清ＡＬＴ明顯升高（圖逡逑１Ａ）；邋ＮＡＳＨ鼠肝臟外觀呈現(xiàn)淡黃色（圖ＩＢ）；邋ＨＥ結(jié)果顯示ＭＣＤ及ＨＦＤ處理逡逑后肝細(xì)胞發(fā)生明顯空泡化（圖１Ｃ），提示肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)沉積；０Ｒ０染色結(jié)逡逑果進(jìn)一步表明，與ＮＤ小鼠相比較，ＭＣＤ及ＨＦＤ處理后肝臟內(nèi)脂滴沉積均明顯逡逑增多（圖１Ｄ）。上述結(jié)果均表明ＮＡＳＨ小鼠建模成功。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑５００１邐１５＆］邐＊邐ＮＤ邐ＭＣＤ邋ＮＤ邐ＨＦＤ逡逑ｒ邐４■魏邐｜，

本文編號：2598684