發(fā)布時間：2020-03-24 02:51

【摘要】： 幽門螺桿菌(H.pylori.Hp)在全球的感染率超過50%,它是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子,還與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。H.pylori侵入機體后能夠產(chǎn)生損傷胃粘膜的毒素,并誘發(fā)機體一系列炎癥、免疫反應(yīng),這與其在胃粘膜定植生存有關(guān)。致病的H.pylori菌株含有一個約40kb的特殊基因片段,即cag致病島(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),該基因序列呈高密度分布并編碼一個分泌轉(zhuǎn)運系統(tǒng)稱為Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,TFSS)。在H.pylori粘附定植的過程中,H.pylori致病因子是通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運進入宿主細(xì)胞的,在轉(zhuǎn)運過程中CagL蛋白的參與非常重要。它通過H.pylori菌毛與宿主接觸,導(dǎo)致黏著斑激酶(FAK)和Src家族激酶(Src familykinases, SFKs)的活化及酪氨酸磷酸化,誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架重新排列,細(xì)胞漿膜的動態(tài)變化,整合素的聚集及其它受體的活化;同時活化的Src刺激下游信號系統(tǒng),導(dǎo)致宿主細(xì)胞誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子如IL-8的合成和分泌。CagL的這些生物學(xué)行為對H.pylori致病因子進入宿主的細(xì)胞和引發(fā)宿主細(xì)胞病理改變極為重要。因此,本研究擬對CagL基因進行克隆表達,制備多克隆抗體進行阻斷粘附試驗,這將有助于進一步明確CagL在H.pylori致病性及定植機制中的作用,并為研制H.pylori疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果: 1.重組幽門螺桿菌CagL蛋白的表達、純化 采用PCR方法以H.pylori(NCTC 11639株)基因組DNA為模板,擴增cagL基因片段并構(gòu)建在原核表達載體PET-22b(+)中,通過酶切、測序鑒定陽性重組子。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示,幽門螺桿菌cagL基因被正確克隆到PET-22b(+)中。 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的H.pylori基因序列進行相似性分析。克隆cagL基因的核苷酸序列長度為714bp,與GenBank中(11639)序列比較,基因相似性為100%。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE分析,目的蛋白表達率約為40%,超聲破菌后電泳鑒定目的蛋白以包涵體形式表達。用?KTA-explore純化系統(tǒng)純化出CagL。用SDS-PAGE對純化產(chǎn)物分析表明CagL的純度90%。Western blot結(jié)果顯示重組幽門螺桿菌CagL蛋白具有與抗H.pylori多克隆抗體血清的免疫反應(yīng)性; 2制備兔抗CagL多克隆抗體血清及其鑒定 以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔,制備兔抗CagL多克隆抗體血清,雙擴試驗和ELISA試驗鑒定其免疫性。ELISA檢測出多克隆血清的效價為1:16,000。經(jīng)雙向免疫擴散檢測,多克隆血清效價為1:16。 3兔抗CagL多克隆抗體血清對幽門螺桿菌粘附阻斷實驗: 3.1 CagL多克隆抗體血清對幽門螺桿菌粘附阻斷實驗 將幽門螺桿菌接種于H.pylori選擇培養(yǎng)基中,在5% O_2,85% N_2,10% CO_2,37℃條件下培養(yǎng),24h后挑菌進行形態(tài)及生化鑒定。將H.pylori培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600nm=0.6)。再將H.pylori和CagL多克隆抗體中和后加入貼壁生長在蓋玻片上的Hela細(xì)胞中,37℃、5%CO_2共同孵育4h,分別加入H.pylori和DH5α菌作為陽性對照及陰性對照。姬姆薩染色結(jié)果顯示CagL多克隆抗體有阻斷幽門螺桿菌粘附定植Hela細(xì)胞能力。 3.2酶聯(lián)免疫吸附測定分析IL-8濃度 用3.1的操作方法,取細(xì)胞上清液,用酶聯(lián)免疫吸附測定分析IL-8濃度。結(jié)果顯示:CagL多克隆抗體血清預(yù)先中和的H.pylori和未中和的H.pylori對照間有顯著性差異(p0.05),前者IL-8水平顯著低于后者。表明CagL多克隆抗體血清與H.pylori抗原充分結(jié)合后,可以減少H.pylori促進細(xì)胞分泌IL-8的能力。 結(jié)論: 本研究成功構(gòu)建、表達、純化出的重組幽門螺桿菌CagL蛋白,具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。阻斷粘附實驗說明制備的CagL多克隆抗體血清對阻斷H.pylori的粘附能力發(fā)揮了重要的作用。細(xì)胞因子IL-8的檢測表明CagL多克隆抗體血清可以減少H.pylori促進細(xì)胞分泌IL-8的能力。以上實驗說明CagL蛋白在H.pylori定植并轉(zhuǎn)化CagA進入細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞表達IL-8方面具有重要的作用。本研究為H.pylori致病性及定植機制研究奠定了基礎(chǔ),并為進一步探索其在H.pylori疫苗研制中的潛在作用提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

PCR擴增得到cagL基因片段，，大小約為714bp(見圖1-1)，片段大小與預(yù)期相符。1:DNA marker2:PCR product of cagL (714bp)圖 1-1 瓊脂糖電泳檢測 PCR 擴增產(chǎn)物Fig1-1 Analysis of PCR product by agarose gel electrophoresis二、重組質(zhì)粒pMD-18T-CagL酶切鑒定將擴增片段回收純化后與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化受體菌DH5α經(jīng)氨芐青霉素篩選，增菌后抽提質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和NdeⅠ雙酶切后電泳檢測，在約714bp處可見到酶切片段，如圖1-2所示。26

圖 1-4 SDS-PAGE 檢測重組蛋白 PET22b(+)-CagL 表達(搖瓶)Fig 1-4 The expression of induced CagL by SDS-PAGEe of PET-22b(+)/BL21 before IPTG induction；2：lysate of PET-22induced with IPTG for 4h; 3：protein molecular weight marker2b(+)-CagL recombinant strain induced with IPTG for 0h、1h、2h、4h
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R573

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本文編號：2597677