【摘要】：HCV是導(dǎo)致慢性肝炎的主要病原體之一,全球感染人數(shù)大約為1.7億。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)屬單股正鏈RNA病毒、黃病毒科、肝炎病毒屬,基因全長(zhǎng)約9.6kb。由于病毒復(fù)制過(guò)程中,RNA依賴(lài)的RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能,導(dǎo)致HCV基因組中核苷酸突變頻率極高。核酸突變所致的HCV遺傳多樣性可以表現(xiàn)在不同水平,根據(jù)HCV的核苷酸序列的同源性,可將HCV分為6個(gè)基因型,和至少80多個(gè)基因亞型。HCV眾多基因型、亞型的主要流行區(qū)域、主要傳播途徑及其起源、進(jìn)化特點(diǎn)都存在著區(qū)別。如3型主要流行于亞洲、北美及歐洲部分地區(qū)；4型主要流行于中非、中東和歐洲地區(qū)；5型主要發(fā)現(xiàn)于非洲和歐洲部分國(guó)家；6型則主要在東南亞和北美地區(qū)流行。1、3、6型主要是通過(guò)靜脈吸毒傳播,輔助血液等原因；2型主要是通過(guò)奴隸交易的方式傳播；4、5型主要是通過(guò)不潔針具和醫(yī)療事故等原因傳播。我國(guó)流行的HCV有1、2、3和6四種基因型,其中北方仍以1b和2a型為主要流行基因型,3型和6型近年來(lái)在華南、西南地區(qū)快速傳播。 利用現(xiàn)代病毒變異與進(jìn)化分析方法,深入了解云南省HCV不同基因型差異性流行與進(jìn)化特點(diǎn),對(duì)闡明云南省HCV的分子流行病學(xué)特征,針對(duì)性制定丙型肝炎預(yù)防控制策略具有重要意義。鑒于此,我們選取云南地區(qū)分別采集自2005、2008和2010年每年各50例的HCV抗體陽(yáng)性樣本。通過(guò)基因序列同源關(guān)系發(fā)現(xiàn),三年的樣本共包含4種基因型(1/2/3/6)和9種基因亞型(1b/2a/3a/3b/6a/6m/6n/6v/6k),其中2005年完成基因測(cè)序的34例樣本分型包括6種基因亞型,分別為1b(14,41.3%)、2a(6,17.6%)、3b(9,26.3%)、6n(2,5.9%)、6v(1,3.0%)、6k(2,5.9%)；2008年40例樣本包括6種基因亞型,分別為1b(8,20.0%)、2a(9,22.5%)、3a(3,7.5%)、3b(18,45.0%)、6a(1,2.5%)、6n(1,2.5%)；2010年40例樣本包括1b(13,32.5%)、3a(8,20.0%)、3b(16,40.0%)、6m(1,2.5%)、6n(2,5.0%)5種基因亞型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),2005-2010年間云南地區(qū)主要以1b(共35例,30.7%)和3b(共43例,37.7%)為主要流行基因型,部分基因型分布在三年內(nèi)有顯著變化,其中3a亞型由2005年的0(0%)例增長(zhǎng)到2010年的8(20.0%)例,2a卻由2005年的6(17.6%)例減少到2010年的0(0%)例。進(jìn)而,我們基于3b基因型內(nèi)毒株的序列變異,使用BEAST軟件計(jì)算其起源時(shí)間和進(jìn)化速率,中國(guó)簇的起源時(shí)間為1949左右,其進(jìn)化速率為0.55E-03,分通過(guò)與鄰近地區(qū)參考株對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)云南流行的3b毒株直接傳播源頭為東南亞國(guó)家,更早的源頭可能是巴基斯坦。另外,云南地區(qū)流行的3b型HCV還因人群的不同有很大差異,從同源關(guān)系上明顯分為靜脈吸毒人群和非吸毒人群兩個(gè)簇,Bayesian skyline plot (BSP)分析發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)人群之間HCV已發(fā)生交叉?zhèn)鞑ァ?6u基因型自2003年在云南省靜脈吸毒人群中開(kāi)始發(fā)現(xiàn),其流行呈逐年增多的趨勢(shì),為探討6u型病毒快速流行的分子機(jī)制,需要構(gòu)建6u/2a嵌合型病毒培養(yǎng)體系,以了解6u型病毒的增殖特點(diǎn)。我們首先擴(kuò)增獲得完整的Core-E1-E2-p7-NS2區(qū)基因區(qū)段(長(zhǎng)約3100bp)。在此過(guò)程中,將目的片段分成四個(gè)片段(分別命名為片段1-4)分別進(jìn)行擴(kuò)增,長(zhǎng)度分別為542bp、980bp、861bp、708bp,利用重疊模板PCR技術(shù)進(jìn)行拼接,漸次獲得更長(zhǎng)基因區(qū)段。將獲得長(zhǎng)基因區(qū)段經(jīng)雙酶切(AgeI和SpeI)后,插入已有的J6/JFH1質(zhì)粒中,構(gòu)建重組質(zhì)粒。以線性化的重組質(zhì)粒模板,體外轉(zhuǎn)錄獲得重組病毒全長(zhǎng)RNA,經(jīng)提取純化后轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)HCV核酸進(jìn)行定性、定量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)病毒RNA可在細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá),測(cè)得胞內(nèi)外病毒載量均為105左右,初步確認(rèn)病毒已進(jìn)行有效增殖。 本研究對(duì)云南省HCV基因型流行分布,進(jìn)行了跨年度系統(tǒng)研究,總結(jié)了2005-2010年云南省HCV基因型的流行分布特征,分析了云南省3b型的起源進(jìn)化關(guān)系,并推測(cè)出云南省HCV基因型未來(lái)的分布特點(diǎn)。此外,本研究結(jié)合了本省首次發(fā)現(xiàn)的6u型毒株,構(gòu)建了嵌合體病毒6u/JFH1,并進(jìn)行了初步分析。為未來(lái)云南省做好HCV的預(yù)防控制策略提供了研究依據(jù),為HCV致病機(jī)制及疫苗研制等方面的研究提供技術(shù)平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2597607