【摘要】：肝臟承擔(dān)著機(jī)體物質(zhì)代謝和生物轉(zhuǎn)化的功能,血液供應(yīng)豐富,因此肝臟易受到體內(nèi)外的各種病原和刺激因子的侵襲,引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)。肝臟長時期處于損傷狀態(tài),往往會導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟自我防護(hù)的損傷-修復(fù)反應(yīng),是一種漸進(jìn)的病理過程。其疾病特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)沉積,造成肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉和結(jié)節(jié)形成,嚴(yán)重的肝纖維化可以發(fā)展為肝硬化,甚至肝癌。近年來研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化在去除了損傷因素后是可以逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的,表現(xiàn)為沉積的膠原降解,肝臟結(jié)構(gòu)和肝臟功能的恢復(fù)。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖在肝纖維化形成過程中起關(guān)鍵作用因此,減少肝星狀細(xì)胞的增殖成為阻止肝纖維化進(jìn)程的途徑之一。文獻(xiàn)表明,在肝纖維化形成階段瘦素(Leptin)及其受體(OB-Rb)的表達(dá)逐漸增加,可通過直接與星狀細(xì)胞膜OB-Rb結(jié)合激活星狀細(xì)胞,亦或與枯否細(xì)胞膜OB-Rb結(jié)合,激活枯否細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)等促纖維化細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖,在肝纖維化形成過程中發(fā)揮了重要的作用。但是在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期,瘦素及其受體的表達(dá)變化以及這種變化對肝星狀細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子TGF-β1會產(chǎn)生的影響未見文獻(xiàn)報道。 為此,本研究選用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型,觀察肝纖維化逆轉(zhuǎn)的不同時期瘦素及其受體的變化,探討該變化與肝纖維化逆轉(zhuǎn)的相關(guān)關(guān)系以及對可能的影響機(jī)制。研究內(nèi)容主要包括以下兩個部分: 1、Leptin及TGF-β1與CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的相關(guān)性研究 CCl4是經(jīng)典的肝纖維化誘導(dǎo)劑,可直接損傷肝細(xì)胞,通過炎癥細(xì)胞集聚、釋放細(xì)胞因子觸發(fā)間質(zhì)組織的過量產(chǎn)生,誘導(dǎo)大鼠形成肝纖維化;去除CCl4刺激后,肝臟炎癥、肝細(xì)胞變性和壞死減輕,纖維化程度減輕,肝纖維化自然逆轉(zhuǎn)恢復(fù),這一過程可能與多種因素有關(guān),但具體機(jī)制尚未明了。本研究采用SD大鼠背部皮下注射CCl412周,形成肝纖維化化,分別于停注后0周、2周、4周、6周、8周處死實(shí)驗(yàn)動物,動態(tài)觀察肝組織病理和肝纖維化指標(biāo)的變化,結(jié)果顯示停注CCl4后大鼠肝組織病理逐漸減輕,肝指數(shù)、肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和羥脯氨酸(Hyp)亦不斷降低,至逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周時,各項(xiàng)指標(biāo)與正常組,比較無顯著性差異,肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)。研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致,證明本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型,為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。 Leptin及TGF-β1在肝纖維化形成過程中具有重要的作用。Leptin是肝纖維化的始動因素之一,可與HSC、枯否細(xì)胞上表達(dá)的OB-Rb結(jié)合,經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)信號通路,激活肝星狀細(xì)胞和促肝維化細(xì)胞因子分泌,促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。TGF-β1對纖維化時形成的細(xì)胞外基質(zhì)具有重要調(diào)控作用,與TGF-βRⅠ結(jié)合后激活HSC內(nèi)Smad信號通路,促進(jìn)HSC增殖,調(diào)節(jié)ECM合成與沉積。本研究觀察到在肝纖維化自然逆轉(zhuǎn)恢復(fù)過程中,血清及組織Leptin和TGF-β1在恢復(fù)0w時表達(dá)顯著增高,經(jīng)過2、4、6、8w恢復(fù)后逐漸降低,其下降趨勢與肝纖維化血清及組織學(xué)指標(biāo)HA、CⅣ、Hyp變化呈顯著正相關(guān)(P0.01),表明Leptin及TGF-β1下降對肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)具有重要作用。進(jìn)一步檢測OB-Rb和TGF-βRⅠmRNA表達(dá),結(jié)果顯示在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)過程中,受體表達(dá)逐漸下調(diào);同時檢測核轉(zhuǎn)錄因子-κb(NF-κb)的蛋白表達(dá)變化,亦出現(xiàn)相同趨勢。因此,Leptin及TGF-β1水平的下降,使OB-Rb和TGF-βRⅠ表達(dá)下調(diào),影響了NF-κb激活,可能是影響肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的機(jī)制之一。 2、JAK/STAT信號通路在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期肝星狀細(xì)胞的變化及瘦素對轉(zhuǎn)化生長因子β1分泌的影響 JAK-STAT通路是瘦素的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,瘦素與其受體OB-Rb結(jié)合可引起JAK1、JAK2及受體胞質(zhì)區(qū)磷酸化,并進(jìn)一步使下游胞質(zhì)蛋白STAT磷酸化,STAT磷酸化后轉(zhuǎn)核內(nèi),調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。文獻(xiàn)表明,JAK-STAT通路的激活對HSC活化增殖以及各種促纖維化細(xì)胞因子的分泌具有重要調(diào)控作用。然而在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期,該通路各蛋白的表達(dá)變化情況未見文獻(xiàn)報道。本部分研究中,我們采用肝臟原位灌流、密度梯度離心的方法分離得到正常組、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)0周、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組大鼠HSC,觀察OB-Rb、JAK-STAT通路蛋白變化情況。同時選擇瘦素對HSC的最佳刺激濃度,觀察TGF-β1分泌。結(jié)果顯示,肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)4周組大鼠HSC上OB-Rb表達(dá)較低,JAK、STAT磷酸化程度較逆轉(zhuǎn)恢復(fù)0周組顯著降低。100ng·mL-1為瘦素最佳刺激濃度,作用于HSC后,TGF-β1蛋白分泌較正常對照組顯著升高;Leptin+AG490(JAK蛋白特異性阻滯劑)作用HSC后僅檢測到少量的TGF-β1,與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。可見JAK-STAT通路是Leptin調(diào)節(jié)TGF-β1分泌的重要途徑。因此,在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期,體內(nèi)瘦素水平的降低,OB-Rb蛋白表達(dá)下調(diào), JAK/STAT信號途徑活化程度降低,使TGF-β1分泌減少,進(jìn)而減輕對HSC的刺激,從而對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)產(chǎn)生影響。
【圖文】：

圖 1 肝組織切片 HE 染色 ×200Fig 1 Photomicrographs of liver sections stained with HE trichrome(original magnification×200 )l；B： 0wk spontaneous recovery；C： 2wk spontaneous recovery；D： 4wk spery；E： 6 wk spontaneous recovery；F： 8 wk spontaneous recovery；B：恢復(fù) 0 周組；C：恢復(fù) 2 周組；D：恢復(fù) 4 周組；E：恢復(fù) 6 周組；誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型逆轉(zhuǎn)恢復(fù)肝膠原檢查動態(tài)變化（Masson）son 染色結(jié)果顯示：正常大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，，，排列整齊，肝細(xì)胞完整，無異常纖維增生，匯管區(qū)無纖維組織 12wk 的大鼠有較多的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，纖維結(jié)締組織增生，增多線條狀纖維間隔，分割肝小葉，使小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂

圖 2 肝組織切片 Masson 染色 ×200ig2 Photomicrographs of liver sections stained wkith Masson’s trichrome st(original magnification×200 )trol；B： 0wk spontaneous recovery；C： 2wk spontaneous recovery；D： 4wkovery；E： 6 wk spontaneous recovery；F： 8 wk spontaneous recovery組；B：恢復(fù) 0 周組；C：恢復(fù) 2 周組；D：恢復(fù) 4 周組；E：恢復(fù) 6 周組組l4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型逆轉(zhuǎn)恢復(fù)肝臟指數(shù)的動態(tài)變化指數(shù)是反映肝臟炎癥和脂肪變性程度的重要指標(biāo)之一。結(jié)果顯示相比， CCl4注射 12wk 模型大鼠體重均明顯減輕，肝臟指數(shù)均.01）；在停止注射 CCl4經(jīng) 2wk、4wk、6wk 和 8wk 的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)，各明顯增加，肝臟指數(shù)顯著下降。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

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本文編號：2597226