【摘要】：目的： 研究羥基喜樹堿（hydroxycamptothecine,HCPT）對肝星狀細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor,AIF）及死亡受體途徑相關(guān)蛋白FAS、FASL表達(dá)的影響，初步探討HCPT誘導(dǎo)HSC-T6凋亡的作用機(jī)制。 方法： 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，待肝星狀細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)用無糖DMEM培養(yǎng)使細(xì)胞同步化，將細(xì)胞分為兩大組：①對照組：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞各1h,6h,12h及24h（分別用B1、B6、B12、B24表示）；②HCPT實(shí)驗(yàn)組：用濃度為0.5mg/LHCPT進(jìn)行干預(yù)HSC-T6細(xì)胞,各培養(yǎng)1h,6h,12h及24h（分別用H1、H6、H12、H24表示），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。干預(yù)時(shí)間完成后收集各組的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測：①吖啶橙/溴化乙錠染色觀察HSC-T6細(xì)胞的凋亡情況；②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測AIF、Fas、FASL基因水平的表達(dá)；③Western blot印記法檢測AIF、FAS、FASL蛋白水平的表達(dá)；④激光共聚焦顯微鏡觀察AIF在細(xì)胞凋亡時(shí)胞內(nèi)定位的變化。 結(jié)果： 1、吖啶橙/溴化乙錠雙重染色：對照組細(xì)胞培養(yǎng)1h、6h、12h、及24h后染色均未見明顯改變，細(xì)胞凋亡率均較低，各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）；0.5mg/L HCPT作用于肝星狀細(xì)胞株HSC-T61h、6h，未見明顯的細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率與各對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05）；作用12h及24h后可見細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞體積縮小、皺縮、細(xì)胞核碎裂，較對照組及作用1h、6h后的細(xì)胞凋亡率明顯升高（P值均0.05），且HCPT作用24h組細(xì)胞凋亡率高于HCPT作用12h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 2、RT-PCR檢測AIF、Fas、FASL的表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組AIF的表達(dá)量與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05），正常組及實(shí)驗(yàn)組均未見Fas及FASL表達(dá)。 3、Western blot印記法檢測AIF、FAS、FASL的表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組AIF的表達(dá)量與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均0.05），正常組及實(shí)驗(yàn)組均未見Fas及FASL表達(dá)。 4、激光共聚焦顯微鏡觀察AIF的位移變化：對照組細(xì)胞的細(xì)胞漿呈紅色，為AIF的正常定位染色，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈亮藍(lán)色熒光，核漿結(jié)構(gòu)清晰；經(jīng)HCPT作用1h及6h后，細(xì)胞漿仍呈紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，12h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紅染，但發(fā)生紅染的細(xì)胞較少，24h后細(xì)胞核發(fā)生紅染的細(xì)胞數(shù)顯著增加，許多經(jīng)DAPI染藍(lán)色的細(xì)胞核出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。 結(jié)論： HCPT可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的程度可能與作用時(shí)間成正比；HCPT作用機(jī)制可能為凋亡誘導(dǎo)因子相關(guān)的線粒體凋亡途徑，即HCPT促使AIF從線粒體發(fā)生位移至細(xì)胞核內(nèi)，激活細(xì)胞核內(nèi)的凋亡信號，，促進(jìn)HSC-T6發(fā)生凋亡；同時(shí)本研究反映FAS/FASL可能未參與HCPT誘導(dǎo)HSC凋亡的過程。
【圖文】：

A：DMEM 培養(yǎng) 1h；B：DMEM 培養(yǎng) 6h；C：DMEM 培養(yǎng) 12h；D：DMEM 培養(yǎng) 24h；E：HCPT 作用 1h 組；F：HCPT 作用 6h 組；G：HCPT 作用 12h 組；H：HCPT 作用 24h 組圖 1 HCPT 處理前后吖啶橙/嗅化乙啶雙重染色結(jié)果 ×40（2）如表2、圖2所示對照組之間細(xì)胞的凋亡率差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值>0.05）；經(jīng)HCPT作用1h、6h后細(xì)胞的凋亡率與各對照組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值>0.05）。經(jīng)HCPT作用12h、24h后細(xì)胞的凋亡率與其他各組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05），經(jīng)HCPT作用24h組較經(jīng)HCPT作用12h組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05）。表 2 AO/EB 染色檢測細(xì)胞的凋亡率分組 n 細(xì)胞凋亡率B1 6 3.89％±0.58％#B6 6 3.88％±0.57％★#B12 6 3.88％±0.58％★#B24 6 3.89％±0.57％★#H1 6 3.74％±0.67％★#H6 6 3.97％±0.52％★#H12 6 27.85％±0.98％▲#H24 6 50.64％±1.06％▲

HCPT 對肝星狀細(xì)胞 AIF、FAS、FASL 表達(dá)的影響.1 AIF、FAS、FASL 基因的表達(dá)如圖 3、圖 4 所示各對照組間 AIF 的表達(dá)（正常培養(yǎng) 1h 組-A1：0.745±0培養(yǎng) 6h 組-A2：0.747±0.163，正常培養(yǎng) 12h 組-A3：0.742±0.147，正常 組-A4：0.745±0.105）差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值>0.05）；經(jīng) 1h、6h、12h、24hAIF 的 mRNA 表達(dá)（A5：0.747±0.163，A6：0.737±00.732±0.160，A8：0.730±0.141）與各對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值>0 HCPT 作用后的 4 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間 AIF 的表達(dá)（A5、A6、A7、A明顯，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值>0.05）（具體相對表達(dá)數(shù)值見表 3）。對驗(yàn)組均未見 FAS 及 FASL 表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 卓強(qiáng);鄭仁源;葉平;唐文;梅浙川;蔣明德;;SB203580對大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡及bcl-2蛋白表達(dá)影響[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年09期

2 邵佳亮;萬贊燕;胡國信;;四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型改良的研究[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

3 李先茜;邵世和;傅桂蓮;韓曉紅;高虹;;Study on Norcantharidin-induced Apoptosis in SMMC-7721 Cells through Mitochondrial Pathways[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2010年05期

4 廖立新;潘登;陳剛?cè)?李莉;;羥基喜樹堿與人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年33期

5 龍騰河;農(nóng)村立;郭塹;;肝纖維化的影像學(xué)診斷[J];中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志;2010年04期

6 韓萍;張健;李永綱;邵清;李冰;李梵;陳國鳳;;瞬時(shí)彈性掃描診斷肝纖維化準(zhǔn)確性研究[J];傳染病信息;2010年03期

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9 肖冬梅;楊漢豐;杜勇;;肝纖維化的磁共振彈性成像研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年05期

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本文編號：2597001