【摘要】：背景與目的 腸易激綜合征(IBS)是一種以腹痛伴有排便頻率和/或糞便性狀改變的功能性胃腸病,目前發(fā)病機(jī)制仍待闡明。研究發(fā)現(xiàn)IBS患者存在多層面免疫系統(tǒng)激活,尤其是部分IBS患者血清中存在多種抗神經(jīng)元抗體(aNA),可引起針對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的免疫反應(yīng),導(dǎo)致ENS內(nèi)神經(jīng)元損傷。慢性假性腸梗阻(CIPO)患者aNA陽(yáng)性血清能促使神經(jīng)細(xì)胞自噬,而IBS患者抗腸神經(jīng)元抗體(AENA)陽(yáng)性血清能導(dǎo)致腸神經(jīng)元凋亡。本研究目的:明確IBS患者抗HuD抗體陽(yáng)性血清或商品化抗HuD抗體能否導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞自噬,并闡釋其損傷機(jī)制,探究抗HuD抗體在IBS發(fā)病中的病理生理作用。材料與方法 采用符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)的IBS患者和健康受試者血清,參考前期應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)AENA、HuProtTM芯片檢測(cè)血清中差異性抗體的結(jié)果。分別選擇IBS患者AENA陰性且差異性抗體陰性血清(AENA-/PRO-組)、AENA陽(yáng)性且抗HuD抗體陰性血清(AENA+/HuD-組)、AENA陰性且抗HuD抗體陽(yáng)性血清(AENA-/HuD+組)、商品化單克隆鼠抗人HuD抗體(anti-HuD組)、健康受試者血清(HCs組)孵育培養(yǎng)SH-Sy5Y細(xì)胞24小時(shí),并用胎牛血清(FBS組)孵育作為陰性對(duì)照,用雷帕霉素(rapamycin組)誘導(dǎo)自噬作為陽(yáng)性對(duì)照。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,間接免疫熒光法(抗LC3-Ⅱ/抗PGP 9.5/DAPI染色)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞自噬,western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、Beclin-1的表達(dá);透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變,明確有無(wú)自噬體的形成。結(jié)果 倒置顯微鏡下見(jiàn)anti-HuD組細(xì)胞生長(zhǎng)密度減小,胞體縮小,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,突起減少,折光性減弱;FBS組、HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組細(xì)胞形態(tài)正常,生長(zhǎng)良好。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性顯示:anti-HuD組細(xì)胞活性顯著低于FBS組、HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組(P0.05)。間接免疫熒光顯示:除rapamycin組外,其余各組均未見(jiàn)胞漿內(nèi)抗LC3-II抗體綠色熒光濃聚,提示無(wú)自噬體形成。Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示 FBS 組、HCs 組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組、AENA-/HuD+組和anti-HuD組間LC3-II蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異(均P0.05),且均顯著低于rapamycin 組(P0.05)。HCs 組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和 AENA-/HuD+組P62蛋白表達(dá)量顯著高于FBS組、anti-HuD組和rapamycin組(P0.05),rapamycin 組 P62 蛋白表達(dá)量低于 FBS 組(P0.05);AENA+/HuD-組、AENA-/HuD+組和anti-HuD組p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著高于FBS組(P0.05),AENA-/HuD+組和anti-HuD組p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著高于HCs組,而rapamycin組p-mTOR蛋白表達(dá)量較其余各組均顯著減少(P0.05);AENA-/HuD+組、anti-HuD組和rapamycin組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于FBS組(P0.05)。電鏡觀察見(jiàn)HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)疏松,形成空洞,且可見(jiàn)脂滴和糖原堆積;Anti-HuD組同樣可見(jiàn)部分細(xì)胞存在胞質(zhì)疏松、脂滴增多和糖原堆積現(xiàn)象,且可見(jiàn)死亡細(xì)胞;除rapamycin組外,其余各組內(nèi)均未見(jiàn)自噬體形成。結(jié)論 商品化單克隆鼠抗人HuD抗體可顯著引起SH-Sy5Y細(xì)胞損傷和死亡,該作用可能是通過(guò)抑制細(xì)胞自噬,激活細(xì)胞凋亡或壞死等其他途徑實(shí)現(xiàn)的。IBS患者抗HuD抗體陽(yáng)性血清可致SH-Sy5Y細(xì)胞損傷并影響自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。人血清,特別是IBS患者血清中的部分物質(zhì)可影響SH-Sy5Y細(xì)胞的糖脂代謝過(guò)程,對(duì)細(xì)胞造成損傷�？笻uD抗體所致神經(jīng)元損傷可能與部分IBS患者的發(fā)病相關(guān)。
【圖文】：

免疫染色一抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑免疫熒光染色二抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＰＡＧＥ預(yù)制膠（１０％、１２％）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白上樣緩沖液（ｌｏａｄｉｎｇ邋ｂｕｆｆｅｒ，，５Ｘ）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白酶碟酸酶抑制劑混合物（５０Ｘ）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＲＩＰ媒解液邐Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑ＢＣＡ蛋白濃度測(cè)定試劑盒邐Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（５．０ｍｇ／ｍｌ）邐Ａｐｐｌｙ邋ｇｅｎ逡逑蛋白預(yù)染ｍａｒｋｅｒ邐Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逡逑脫脂奶粉邐ＢＤ邋Ｄｉｆｃｏ逡逑Ｗｅｓｔ邋ｅｍ一抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑Ｓｕｐｅｒｓ邋ｉｇｎａｌ邋ｗｅｓｔ邋ｆｅｍｔｏ最高靈敏度化學(xué)發(fā)光液邐Ｔｈｅｒｍｏ逡逑（３）免疫熒光染色所用抗體逡逑見(jiàn)表２。逡逑表２疫熒光染色所用抗體邐逡逑

ａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｒａｐａｍｙｃｉｎ，邋ｍＴＯＲ）復(fù)合物邋１邋（ｍＴＯＲ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋１，ｍＴ常被認(rèn)為是調(diào)控自噬的閥門，其起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。當(dāng)ｍＴＯＲＣｌ活性被抑的哺乳動(dòng)物ｕｎｃ－５１－樣激酶１邋（ｕｎｃ－５１－ｌｉｋｅ邋ｋｉｎａｓｅ邋１，邋ＵＬＫ１）和Ａｇｔｌ３磷酸化，導(dǎo)致ＵＬＫ１激酶的活化并誘導(dǎo)自噬發(fā)生。其后下游的Ｂｅｃｌｉｎ－１酸化，并作為ＩＩＩ型枺脂酰肌醇３激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３－ｋｉｎ／Ｂｅｃｌｉｎ－１復(fù)合物的整體支架，促進(jìn)胞漿內(nèi)的ＬＣ３－Ｉ向ＬＣ３－ＩＩ轉(zhuǎn)變，并膜上，進(jìn)一步形成成熟的自噬體［３６：。Ｐ６２，亦稱為ＳＱＳＴＭ１，是一個(gè)泛自噬發(fā)生時(shí)，胞質(zhì)中的Ｐ６２—方面與泛素化的蛋白質(zhì)連接，另一方面體膜上的ＬＣ３－ＩＩ蛋白相結(jié)合形成復(fù)合物，以協(xié)助胞漿內(nèi)的受損細(xì)胞器被自噻體包裹，并共同在自噻溶酶體中降解。因此，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Ｐ；而自噬／溶酶體降解途徑被抑制時(shí)，Ｐ６２蛋白則不斷累，證明其表達(dá)反比［３９：。因此應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ＬＣ３－ＩＩ、Ｐ６２、ｐ－ｍＴＯＲ、Ｂｅｃｌ表達(dá)情況，可反映自噬水平的高低。逡逑Ｓｔｒｅｓｓ邋ｓｉｇｎａｌｓ邋／＾＾ＹａＴＧ１３Ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｉｇｎａｌｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R574.4

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本文編號(hào)：2596897