【摘要】：背景與目的 腸易激綜合征(IBS)是一種以腹痛伴有排便頻率和/或糞便性狀改變的功能性胃腸病,目前發(fā)病機制仍待闡明。研究發(fā)現(xiàn)IBS患者存在多層面免疫系統(tǒng)激活,尤其是部分IBS患者血清中存在多種抗神經(jīng)元抗體(aNA),可引起針對腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的免疫反應,導致ENS內(nèi)神經(jīng)元損傷。慢性假性腸梗阻(CIPO)患者aNA陽性血清能促使神經(jīng)細胞自噬,而IBS患者抗腸神經(jīng)元抗體(AENA)陽性血清能導致腸神經(jīng)元凋亡。本研究目的:明確IBS患者抗HuD抗體陽性血清或商品化抗HuD抗體能否導致神經(jīng)細胞自噬,并闡釋其損傷機制,探究抗HuD抗體在IBS發(fā)病中的病理生理作用。材料與方法 采用符合羅馬Ⅲ診斷標準的IBS患者和健康受試者血清,參考前期應用間接免疫熒光法檢測AENA、HuProtTM芯片檢測血清中差異性抗體的結(jié)果。分別選擇IBS患者AENA陰性且差異性抗體陰性血清(AENA-/PRO-組)、AENA陽性且抗HuD抗體陰性血清(AENA+/HuD-組)、AENA陰性且抗HuD抗體陽性血清(AENA-/HuD+組)、商品化單克隆鼠抗人HuD抗體(anti-HuD組)、健康受試者血清(HCs組)孵育培養(yǎng)SH-Sy5Y細胞24小時,并用胎牛血清(FBS組)孵育作為陰性對照,用雷帕霉素(rapamycin組)誘導自噬作為陽性對照。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),CCK-8檢測細胞活性,間接免疫熒光法(抗LC3-Ⅱ/抗PGP 9.5/DAPI染色)檢測神經(jīng)細胞自噬,western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、Beclin-1的表達;透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變,明確有無自噬體的形成。結(jié)果 倒置顯微鏡下見anti-HuD組細胞生長密度減小,胞體縮小,細胞形態(tài)不規(guī)則,突起減少,折光性減弱;FBS組、HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組細胞形態(tài)正常,生長良好。CCK-8檢測細胞活性顯示:anti-HuD組細胞活性顯著低于FBS組、HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組(P0.05)。間接免疫熒光顯示:除rapamycin組外,其余各組均未見胞漿內(nèi)抗LC3-II抗體綠色熒光濃聚,提示無自噬體形成。Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達量,結(jié)果顯示 FBS 組、HCs 組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組、AENA-/HuD+組和anti-HuD組間LC3-II蛋白表達量無顯著差異(均P0.05),且均顯著低于rapamycin 組(P0.05)。HCs 組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和 AENA-/HuD+組P62蛋白表達量顯著高于FBS組、anti-HuD組和rapamycin組(P0.05),rapamycin 組 P62 蛋白表達量低于 FBS 組(P0.05);AENA+/HuD-組、AENA-/HuD+組和anti-HuD組p-mTOR蛋白表達量顯著高于FBS組(P0.05),AENA-/HuD+組和anti-HuD組p-mTOR蛋白表達量顯著高于HCs組,而rapamycin組p-mTOR蛋白表達量較其余各組均顯著減少(P0.05);AENA-/HuD+組、anti-HuD組和rapamycin組Beclin-1蛋白相對表達量顯著高于FBS組(P0.05)。電鏡觀察見HCs組、AENA-/PRO-組、AENA+/HuD-組和AENA-/HuD+組神經(jīng)細胞胞質(zhì)疏松,形成空洞,且可見脂滴和糖原堆積;Anti-HuD組同樣可見部分細胞存在胞質(zhì)疏松、脂滴增多和糖原堆積現(xiàn)象,且可見死亡細胞;除rapamycin組外,其余各組內(nèi)均未見自噬體形成。結(jié)論 商品化單克隆鼠抗人HuD抗體可顯著引起SH-Sy5Y細胞損傷和死亡,該作用可能是通過抑制細胞自噬,激活細胞凋亡或壞死等其他途徑實現(xiàn)的。IBS患者抗HuD抗體陽性血清可致SH-Sy5Y細胞損傷并影響自噬通路相關(guān)蛋白的表達。人血清,特別是IBS患者血清中的部分物質(zhì)可影響SH-Sy5Y細胞的糖脂代謝過程,對細胞造成損傷。抗HuD抗體所致神經(jīng)元損傷可能與部分IBS患者的發(fā)病相關(guān)。
【圖文】：

免疫染色一抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑免疫熒光染色二抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＰＡＧＥ預制膠（１０％、１２％）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白上樣緩沖液（ｌｏａｄｉｎｇ邋ｂｕｆｆｅｒ，，５Ｘ）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白酶碟酸酶抑制劑混合物（５０Ｘ）邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＲＩＰ媒解液邐Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑ＢＣＡ蛋白濃度測定試劑盒邐Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑蛋白標準品（５．０ｍｇ／ｍｌ）邐Ａｐｐｌｙ邋ｇｅｎ逡逑蛋白預染ｍａｒｋｅｒ邐Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逡逑脫脂奶粉邐ＢＤ邋Ｄｉｆｃｏ逡逑Ｗｅｓｔ邋ｅｍ一抗稀釋液邐Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑Ｓｕｐｅｒｓ邋ｉｇｎａｌ邋ｗｅｓｔ邋ｆｅｍｔｏ最高靈敏度化學發(fā)光液邐Ｔｈｅｒｍｏ逡逑（３）免疫熒光染色所用抗體逡逑見表２。逡逑表２疫熒光染色所用抗體邐逡逑

ａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｒａｐａｍｙｃｉｎ，邋ｍＴＯＲ）復合物邋１邋（ｍＴＯＲ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋１，ｍＴ常被認為是調(diào)控自噬的閥門，其起到負性調(diào)節(jié)作用。當ｍＴＯＲＣｌ活性被抑的哺乳動物ｕｎｃ－５１－樣激酶１邋（ｕｎｃ－５１－ｌｉｋｅ邋ｋｉｎａｓｅ邋１，邋ＵＬＫ１）和Ａｇｔｌ３磷酸化，導致ＵＬＫ１激酶的活化并誘導自噬發(fā)生。其后下游的Ｂｅｃｌｉｎ－１酸化，并作為ＩＩＩ型枺脂酰肌醇３激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３－ｋｉｎ／Ｂｅｃｌｉｎ－１復合物的整體支架，促進胞漿內(nèi)的ＬＣ３－Ｉ向ＬＣ３－ＩＩ轉(zhuǎn)變，并膜上，進一步形成成熟的自噬體［３６：。Ｐ６２，亦稱為ＳＱＳＴＭ１，是一個泛自噬發(fā)生時，胞質(zhì)中的Ｐ６２—方面與泛素化的蛋白質(zhì)連接，另一方面體膜上的ＬＣ３－ＩＩ蛋白相結(jié)合形成復合物，以協(xié)助胞漿內(nèi)的受損細胞器被自噻體包裹，并共同在自噻溶酶體中降解。因此，當自噬發(fā)生時，Ｐ；而自噬／溶酶體降解途徑被抑制時，Ｐ６２蛋白則不斷累，證明其表達反比［３９：。因此應用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測ＬＣ３－ＩＩ、Ｐ６２、ｐ－ｍＴＯＲ、Ｂｅｃｌ表達情況，可反映自噬水平的高低。逡逑Ｓｔｒｅｓｓ邋ｓｉｇｎａｌｓ邋／＾＾ＹａＴＧ１３Ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｉｇｎａｌｓ逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R574.4

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