【摘要】：研究目的： 在肝纖維化的形成和逆轉(zhuǎn)過程中，肝星狀細胞的增殖和凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,抑制活化的肝星狀細胞增殖和誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡，是治療肝纖維化的重要措施之一。本研究從整體和離體兩方面觀察肝纖維化時肝組織及肝星狀細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化,并就中藥肝復(fù)康對其影響進行研究，從而為肝纖維化的中藥治療提供實驗依據(jù)。 實驗方法： 整體實驗：將SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、中藥治療組（高、中、低劑量組）。對模型組和中藥治療組用橄欖油稀釋的10%的四氯化碳對其進行皮下注射以制備肝纖維化模型，5ml/kg，2次/周，共90天。對正常對照組，注射物質(zhì)由四氯化碳換成生理鹽水，余方法同前。造模60天后開始用不同劑量的中藥肝復(fù)康對大鼠進行灌胃給藥治療。所用劑量分別為高、中、低，即3125,312.5,31.25mg/kg/天，治療時間為60天。所有大鼠均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飲水活動自由。全部大鼠于最后一次給藥的24小時后處死，迅速取大鼠肝左葉，對其進行分子生物學(xué)及組織學(xué)檢測。 離體實驗：將HSC-T6細胞株放在37°C、5%CO2混合氣體的孵箱中，用含青霉素（100U/ml）、胎牛血清（10%）和鏈霉素（100U/ml）的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)和傳代。當(dāng)細胞狀態(tài)達到良好后，將所有細胞用無血清的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后隨機分為三組，第一組即正常對照組，用含10%正常大鼠血清的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)；第二組即肝復(fù)康治療組（中藥治療組），用含10%肝復(fù)康治療中劑量組大鼠血清和乙醛200umol/L的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)；第三組即乙醛組，用含10%正常大鼠血清和乙醛200umol/L的DEMN培養(yǎng)基培養(yǎng)。將以上三組細胞同時放在孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2混合氣體，培養(yǎng)時間為48h。 本實驗用HE染色法觀察肝組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；用免疫組化法觀察各組肝臟組織中α-SMA的表達；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR）測定肝組織和肝星狀細胞caspase-3, caspase-9，Cyt-C，α-SMA, typeⅠcollagen and type Ⅲcollagen的基因表達水平。 實驗結(jié)果： （1）實驗動物大體觀察：正常對照組大鼠生長狀態(tài)良好，善動，體重不同程度的增加；模型組大鼠在造模后精神萎靡、常常蜷縮、皮毛晦暗、易激惹、進食水減少，體重增長緩慢甚至不同程度下降；中藥治療組大鼠精神、活動量、生長發(fā)育等方面雖較正常組差，但均好于模型組。將大鼠處死后可見：正常對照組大鼠肝臟質(zhì)地柔軟、表面紅潤；模型組大鼠肝臟表面粗糙、多處結(jié)節(jié)、顏色晦暗、肝臟本身發(fā)硬、部分腹腔內(nèi)有腹水；肝復(fù)康治療組大鼠肝臟與模型組相比，質(zhì)地較為柔軟、表面較為光滑。 （2）肝臟組織HE染色的光鏡觀察：正常對照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，紋理清晰，肝索呈放射狀排列并無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝臟可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞腫大，脂肪變性明顯，大量纖維組織增生，纖維間隔內(nèi)有大量單核、淋巴、嗜酸粒及成纖維等細胞存在，部分纖維組織包繞分割肝細胞形成假小葉；肝復(fù)康治療組大鼠肝臟與模型組相比，肝小葉結(jié)構(gòu)改善，肝組織脂肪變性減輕，纖維間隔變細，其中以中劑量治療組大鼠改善明顯，低劑量治療組和高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)也有所改善。各組評分均比模型組明顯降低，三個治療組以中劑量組降低最為明顯。 （3）免疫組織化學(xué)檢測α肌動蛋白（α-SMA）在肝組織中表達：正常對照組α-SMA只表達于小動脈及小靜脈，于膽管中沒有表達；模型組α-SMA呈長梭形或橢圓形，主要表達于匯管區(qū)及纖維間隔。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：α-SMA免疫組織化學(xué)染色面積在模型組中表達明顯升高，在中藥治療組中表達顯著下調(diào)（較模型組），其中以中劑量治療組下調(diào)更加明顯。 （4）RT-PCR檢測大鼠肝組織中凋亡相關(guān)蛋白mRNA的表達： 與正常對照組相比，模型組Cyt-c的表達顯著下調(diào)（P0.01）；而與模型組相比，肝復(fù)康治療組Cyt-c的表達明顯上調(diào)，以中劑量上調(diào)最為明顯（P0.01）。 與正常對照組相比，模型組中凋亡蛋白caspase-3, caspase-9的表達顯著下調(diào)（P0.01）；而與模型組相比，肝復(fù)康治療組中caspase-3, caspase-9的表達顯著上調(diào)，以中劑量最為顯著（P0.01）。 為進一步證實中藥肝復(fù)康的抗肝纖維化作用，本實驗同時檢測了α-肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（ColleganⅠ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）的mRNA表達。與正常對照組比較，，模型組中α-SMA、ColleganⅠ、Collagen Ⅲ表達顯著上調(diào)（P0.01）；而與模型組相比，肝復(fù)康治療組各指標(biāo)表達均明顯下調(diào)，以中劑量最為顯著（P0.01）。 （5）肝復(fù)康對乙醛刺激的大鼠肝星狀細胞株中凋亡相關(guān)蛋白的影響 為找到更加理想的刺激HSC-T6細胞的方法，在預(yù)實驗中分別用CCl4和乙醛對HSC細胞進行刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醛(200umol/L)組肝星狀細胞（HSC）中的α-肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（ColleganⅠ）和Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）等指標(biāo)的表達均明顯增加（P0.01）；乙醛刺激組中cyt-c，caspase-3, caspase-9的表達與正常組相比明顯下調(diào)。 而肝復(fù)康治療組與正常組接近，α-SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等指標(biāo)的表達與乙醛組相比明顯減少（P0.01）；肝復(fù)康治療組中cyt-c，caspase-3, caspase-9的表達與乙醛組相比明顯上調(diào)。 上述細胞實驗的結(jié)果基本與大鼠肝組織結(jié)果相一致。 （6）Cyt-c和caspase-3, caspase-9, Collagen I，Collagen Ⅲ and α-SMA之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示cyt-c和caspase-3、 caspase-9的表達呈正相關(guān)，與CollagenI、Collagen Ⅲ、α-SMA表達呈負相關(guān)。 結(jié)論： 1.肝纖維化大鼠肝組織和肝星狀細胞中caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白表達的變化可能在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。 2.誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達可能是肝復(fù)康治療肝纖維化的機制之一，其作用以中劑量治療效果最佳。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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本文編號：2596615