發(fā)布時間：2020-03-23 09:35

【摘要】：研究背景與目的黃曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)是食物和食品中最常見的真菌代謝產(chǎn)物,屬于二氫呋喃香豆素的衍生物,被國際癌癥研究機構(gòu)歸為I類致癌物。在黃曲霉毒素的幾個亞型中,黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)毒性最大,在人體和動物體內(nèi)也最為常見,肝臟是其主要的靶器官。AFB1進入體內(nèi)后要發(fā)揮活性,首先必須通過細胞色素P450(Cytochrome P450)酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化,生成高度活性的中間產(chǎn)物AFB1-8,9-環(huán)氧化合物(AFB1-8,9-epoxide,AFBO),AFBO則能夠與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合,進而阻斷基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯,影響基因表達。在這一過程中,AFBO代謝會大量消耗谷胱甘肽(glutathione,GSH),造成細胞內(nèi)活性氧累積,產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應,引發(fā)DNA和蛋白損傷,誘導基因突變或細胞凋亡�？梢娫贏FB1代謝過程中所引發(fā)的氧化應激是其致肝細胞損傷的直接原因。目前臨床上治療AFB1中毒也主要是采用體外補充抗氧化劑的方法。然而,目前關(guān)于AFB1引起氧化應激的機制及其中發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子尚不清楚。因此,探尋AFB1致肝細胞氧化應激作用中的關(guān)鍵分子有望為AFB1臨床治療提供新靶點。小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是Caveolin家族成員之一,位于細胞膜和內(nèi)體膜,主要通過自身磷酸化作用參與膽固醇轉(zhuǎn)運、大分子內(nèi)吞等過程。Cav-1能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路,如受體酪氨酸激酶、Src家族酪氨酸激酶(Src,Fyn等)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶及一些下游信號分子H-Ras、MEK、ERK、PI3K/AKT等。Cav-1既是一種抑癌蛋白,又是一種癌蛋白,這種雙重作用依據(jù)細胞類型、癌癥發(fā)展階段的不同而不同,也是近年來研究的熱點問題。Cav-1也被發(fā)現(xiàn)與各種應激有關(guān),包括氧化應激、紫外照射、放射治療,以及與應激相關(guān)信號有關(guān)。最新證據(jù)表明,Cav-1是一種氧化應激相關(guān)蛋白,氧化應激可以影響Cav-1的膜轉(zhuǎn)運。在氧化應激條件下,Cav-1磷酸化與細胞凋亡和細胞附著密切相關(guān),而Cav-1的雙重作用在氧化應激中也有體現(xiàn),如有研究發(fā)現(xiàn)磷酸化Cav-1蛋白表達增加具有抗凋亡作用,可促進氧化應激后細胞存活。也有研究發(fā)現(xiàn)Cav-1表達減少或缺失能夠顯著抑制肺組織中性粒細胞趨化、黏附和上皮細胞/內(nèi)皮細胞凋亡,減輕彌漫性肺泡損傷、肺血管內(nèi)皮屏障損傷及肺水腫程度。我們前期研究發(fā)現(xiàn)AFB1作用過程中能夠引起肝細胞中Cav-1的表達升高以及Cav-1分子定位的改變,提示Cav-1可能參與了AFB1引發(fā)的肝毒性。在此基礎上,我們一方面通過下調(diào)或過表達Cav-1分析其在AFB1引起的肝損傷中的作用,另一方面從對氧化應激的調(diào)控途徑上分析其作用機制。一、Cav-1在AFB1引發(fā)的肝細胞毒性中的作用研究方法:采用人正常肝細胞(L-02),通過細胞增殖實驗、流式細胞術(shù)、免疫熒光、免疫蛋白印跡等方法檢測AFB1作用后引起的肝毒性情況;通過轉(zhuǎn)染質(zhì)�；騭iRNA分別過表達或下調(diào)肝細胞中Cav-1分子的表達,檢測過表達或下調(diào)Cav-1對于AFB1處理引起的肝損傷的影響。此外選取了肝癌細胞系Huh7和HepG2兩種細胞,通過下調(diào)Cav-1的表達分析其對細胞活性和凋亡的影響,以分析Cav-1是否在不同的肝細胞中發(fā)揮相似的作用。實驗結(jié)果:AFB1能夠在肝細胞中發(fā)揮毒性作用,表現(xiàn)為細胞活力下降,細胞凋亡增加,細胞內(nèi)氧化應激水平升高(活性氧水平和MDA含量增加)。進一步發(fā)現(xiàn)AFB1能夠引起Cav-1的表達增加,并引起Cav-1分子的細胞定位明顯改變。在此基礎上,下調(diào)肝細胞中Cav-1的表達后檢測AFB1引發(fā)的肝細胞毒性,發(fā)現(xiàn)肝細胞活力下降明顯減輕,細胞凋亡顯著減少,氧化應激水平明顯降低,而過表達Cav-1后,與上述結(jié)果相反。在肝癌細胞系Huh7和HepG2兩種細胞中重復上述實驗,得到了相似的結(jié)果。結(jié)論:AFB1可通過誘發(fā)氧化應激造成肝細胞損傷,導致肝細胞凋亡。在這一過程中,肝細胞中Cav-1蛋白分子發(fā)揮著重要的作用,AFB1促進了Cav-1的表達,促進了氧化應激。下調(diào)Cav-1的表達能夠抑制AFB1誘發(fā)的氧化應激,提升細胞活力,減少細胞凋亡,提示Cav-1可能是參與AFB1引發(fā)肝細胞氧化應激的關(guān)鍵分子。二、Cav-1在AFB1引發(fā)的肝細胞毒性中的作用機制實驗方法:從抗氧化應激關(guān)鍵通路Keap1-Nrf2信號通路入手,首先通過Western Blot檢測Cav-1下調(diào)或過表達后對Nrf2及下游抗氧化應激重要分子HO-1與NQO-1表達的影響。進而通過免疫共沉淀、熒光酶素等方法檢測Cav-1與Nrf2之間的相互作用,以及Cav-1對于Keap1-Nrf2信號通路的影響。此外,通過Western Blot和免疫熒光等分析Cav-1對AFB1處理后肝細胞自噬水平的影響,進一步利用自噬激活劑和抑制劑明確其作用。利用Wesrern Blot探尋Cav-1調(diào)節(jié)自噬的作用通路。同時,用Huh7和HepG2兩種細胞株分別驗證Cav-1調(diào)節(jié)氧化應激和自噬的作用機制。實驗結(jié)果:通過下調(diào)Cav-1的表達,能夠促進AFB1刺激后肝細胞中抗氧化應激酶Nrf2的表達和轉(zhuǎn)錄,以及HO-1、NQO-1的表達,同時能夠顯著抑制ROS與MDA的水平;反之,過表達Cav-1則發(fā)揮相反的作用。進一步發(fā)現(xiàn)Cav-1可通過與Nrf2直接作用來調(diào)控AFB1引發(fā)的氧化應激水平。Cav-1表達升高后,一方面抑制了Nrf2的轉(zhuǎn)錄,另一方面免疫共沉淀顯示其與Nrf2的相互作用顯著增強,從而影響了Nrf2與Keap1的解離,最終導致細胞的抗氧化應激作用受到抑制;此外,測定自噬標志分子LC3,發(fā)現(xiàn)Cav-1下調(diào)顯著促進了AFB1作用后肝細胞的自噬水平,熒光標記細胞內(nèi)自噬體的形成也得到了相同結(jié)果。自噬激活劑能明顯降低AFB1引發(fā)的細胞毒性,抑制細胞凋亡,而自噬抑制劑則促進了AFB1的細胞毒性作用,促進細胞凋亡,Cav-1可通過調(diào)節(jié)細胞自噬影響AFB1的肝細胞損傷作用。進一步分析Cav-1調(diào)節(jié)自噬作用的信號通路發(fā)現(xiàn),Cav-1在AFB1作用下并未改變經(jīng)典自噬標志分子Beclin1和ATG5的表達,提示其調(diào)節(jié)作用并非通過經(jīng)典自噬調(diào)節(jié)通路。AFB1作用后促進了表皮生長因子受體EGFR的磷酸化,這一作用促進了EGFR下游PI3K以及自噬調(diào)節(jié)因子mTOR的磷酸化激活,從而抑制了自噬作用。應用EGFR的抑制劑阿法替尼后,可明顯促進細胞自噬作用,提升細胞活力,進一步佐證了該結(jié)果。此外,在肝癌細胞系Huh7和HepG2細胞中得到了與L-02細胞相似的結(jié)果。討論:AFB1作用促進了Cav-1與氧化應激反應中關(guān)鍵分子Nrf2的直接相互作用。Cav-1一方面通過調(diào)控Nrf2 mRNA水平,另一方面通過與Nrf2蛋白相互作用,抑制其與Keap1解離,抑制其發(fā)揮抗氧化應激的調(diào)節(jié)作用,促進了AFB1引發(fā)的肝細胞損傷。此外,Cav-1可通過激活EGFR-PI3K-mTOR信號通路來抑制細胞的自噬作用,促進AFB1引發(fā)的肝細胞損傷。小結(jié):AFB1進入體內(nèi)后主要在肝臟中進行代謝,通過與肝細胞中的酶系統(tǒng)或分子相互作用來解毒。AFB1在代謝過程中能夠引發(fā)氧化應激反應,造成肝細胞損傷甚至凋亡。本課題發(fā)現(xiàn)Cav-1為參與AFB1引發(fā)肝細胞損傷的關(guān)鍵分子,AFB1作用促進了肝細胞中Cav-1分子的表達上調(diào)及亞細胞定位的改變。Cav-1在參與AFB1引發(fā)的肝細胞損傷中主要發(fā)揮了兩項重要的調(diào)節(jié)作用:上調(diào)的Cav-1分子一方面通過與Nrf2直接作用以及抑制Nrf2分子表達,從而抑制細胞的抗氧化應激水平,促進細胞活力下降和凋亡;另一方面,Cav-1分子通過激活EGFR-PI3K-mTOR這一非經(jīng)典的自噬調(diào)節(jié)通路,抑制細胞的自噬作用,從而促進毒素引發(fā)的細胞活力下降和細胞凋亡。本研究有助于進一步解釋AFB1致肝臟損傷的作用機制,并挖掘出一個關(guān)鍵分子,這為進一步防治黃曲霉毒素損傷提供了新的藥物治療靶點。
【圖文】：

圖 1.AFB1 作用下肝細胞活力圖 A. 不同濃度的 AFB1 作用于 L-02 細胞 36h 后細胞活力情況，隨著濃度從 5μM-16，細胞活力逐漸降低；圖 B. 40μMAFB1 作用于 L-02 細胞不同時間點的細胞活力情況間的延遲（0h-72h），細胞活力逐漸降低，，作用時間從 24h 開始，細胞活力顯著降低。（P<

圖 2A.AFB1 暴露后肝細胞凋亡情況與正常組相比，AFB1 作用 36h 后，肝細胞凋亡率明顯增加。（P<0.001***）（2）Western Blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白。細胞凋亡的啟動和發(fā)展過程中，半冬氨酸水解酶（Cysteine-requiring Aspartate Protease，Caspase）蛋白家族
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575

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