發(fā)布時間：2020-03-23 03:25

【摘要】：背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指以肝細胞內脂質過度沉積,且既往無過量飲酒史以及其他明確的損肝因素為特征的臨床病理綜合征。NAFLD現(xiàn)在被認為是全球慢性肝病最常見的原因,肝內脂質異常聚集是其發(fā)生發(fā)展的基礎。因此探索如何阻止脂質在肝細胞內異常沉積,對尋求NAFLD新的防治途徑具有重要意義。硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-Co A desaturase 1,SCD1)參與高脂誘導下肝細胞脂肪變性,目前相關機制研究主要涉及調控肝細胞甘油三酯(Triglycerides,TG)合成及脂肪酸氧化。脂質自噬被認為是調節(jié)細胞脂代謝和脂質沉積的一種新機制,激活肝細胞內脂質自噬,可使肝細胞免受脂質沉積的損傷,在NAFLD中具有保護性效應。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路參與自噬的調控,同時又受SCD1水平的影響。前期研究發(fā)現(xiàn),抑制SCD1可激活AMPK信號通路,從而增強自噬促進肝癌細胞凋亡。然而,尚不清楚SCD1是否通過AMPK調節(jié)脂質自噬參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。鑒于此,本課題首先建立棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導的小鼠原代肝細胞脂肪變模型,觀察細胞模型中SCD1與AMPK、脂質自噬表達水平的關系,然后觀察改變SCD1表達水平對小鼠原代肝細胞的脂質沉積、AMPK及脂質自噬的影響,再通過同時增強或抑制SCD1的表達及AMPK活性,探討SCD1是否通過AMPK調控脂質自噬,影響小鼠原代肝細胞的脂質沉積;在此基礎上,觀察抑制體內SCD1表達水平對小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質自噬的影響。本研究結果提示SCD1-AMPK-脂質自噬通路可作為NAFLD的潛在治療靶點。方法:一、脂肪肝細胞模型中SCD1與AMPK、脂質自噬表達水平的關系1.CCK8法篩選PA刺激小鼠原代肝細胞的最適濃度。2.PA刺激小鼠原代肝細胞24h后,用TG酶法測定試劑盒檢測TG含量,油紅O染色檢測肝細胞內的脂滴沉積情況。3.PA刺激小鼠原代肝細胞24h后,用Western-blot檢測SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。二、改變SCD1表達水平對小鼠原代肝細胞的脂質沉積、AMPK及脂質自噬的影響1.si RNA-SCD1轉染小鼠原代肝細胞48h后,用Western-blot檢測SCD1蛋白表達水平,篩選及驗證si RNA-SCD1的沉默效果。2.si RNA-SCD1轉染小鼠原代肝細胞48h后,再用PA刺激肝細胞24h。原代肝細胞分為4組:對照組,si RNA-SCD1組,PA刺激組,PA+si RNA-SCD1組。用TG酶法測定試劑盒檢測TG含量,油紅O染色檢測肝細胞內的脂滴沉積情況。3.用Western-blot檢測上述各組原代肝細胞內的SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。4.SCD1過表達腺病毒(SCD1 overexpression adenoviruse,SCD1-OE)感染小鼠原代肝細胞48h后,用Western-blot檢測SCD1蛋白表達水平,驗證SCD1-OE的過表達效果。5.SCD1-OE感染小鼠原代肝細胞48h后,再用PA刺激肝細胞24h。原代肝細胞分為4組:對照組,SCD1-OE組,PA刺激組,PA+SCD1-OE組。用TG酶法測定試劑盒檢測TG含量,油紅O染色檢測肝細胞內的脂滴沉積情況。6.用Western-blot檢測上述各組原代肝細胞內的SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。三、SCD1通過AMPK調控脂質自噬,影響小鼠原代肝細胞的脂質沉積1.si RNA-SCD1轉染小鼠原代肝細胞48h后,再用PA刺激細胞24h和AMPK抑制劑Dorsomophin刺激細胞2h。原代肝細胞分為8組:對照組,si RNA-SCD1組,Dorsomophin組,si RNA-SCD1+Dorsomophin組,PA刺激組,PA+si RNA-SCD1組,PA+Dorsomophin組,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組。用TG酶法測定試劑盒檢測TG含量,油紅O染色檢測肝細胞內的脂滴沉積情況。2.用Western-blot檢測上述各組原代肝細胞內的SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。3.透射電鏡觀察上述各組原代肝細胞內自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。4.SCD1-OE感染小鼠原代肝細胞48h后,再用PA刺激細胞24h和AMPK激動劑A-769662刺激細胞2h。原代肝細胞分為8組:對照組,SCD1-OE組,A-769662組,SCD1-OE+A-769662組,PA刺激組,PA+SCD1-OE組,PA+A-769662組,PA+si RNA-SCD1+A-769662組。用TG酶法測定試劑盒檢測TG含量,油紅O染色檢測肝細胞內的脂滴沉積情況。5.用Western-blot檢測上述各組原代肝細胞內的SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。6.透射電鏡觀察上述各組原代肝細胞內自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。四、抑制體內SCD1表達水平對小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質自噬的影響1.小鼠分為3組:正常飼料組(normal chow diet group,NCD),高脂飼料組(high fat diet group,HFD),CAY10566處理組(高脂飼料聯(lián)合SCD1抑制劑CAY10566腹腔注射)。3組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)14周,建模完成。全自動生化分析儀檢測各組小鼠的肝功能及血脂水平。2.HE染色及油紅O染色檢測各組小鼠肝臟的脂肪變情況。3.Western-blot檢測各組小鼠肝臟的SCD1、AMPK、自噬相關蛋白LC3和p62的表達。4.透射電鏡觀察小鼠肝臟組織內自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。結果:一、脂肪肝細胞模型中SCD1與AMPK、脂質自噬表達水平的關系1.CCK8結果顯示:324μM是PA刺激小鼠原代肝細胞的最適終濃度。2.TG測定及油紅O結果均顯示:與對照組相比,PA刺激原代肝細胞細胞后,TG含量及脂滴含量均明顯升高(p0.05)。3.Western-blot結果顯示:與對照組相比,PA刺激組SCD1蛋白表達量明顯增高,p-AMPK/t-AMPK比值降低,自噬相關蛋白p62表達量增高,LC3-II/LC3-I的表達比例降低,(p0.05)。二、改變SCD1表達水平對小鼠原代肝細胞的脂質沉積、AMPK以及脂質自噬的影響1.Western-blot結果顯示:si RNA-SCD1-414下調原代肝細胞SCD1蛋白表達的效果最明顯,與空白對照組比較明顯減少(p0.05)。2.TG測定及油紅O結果均顯示:抑制SCD1的表達后,原代肝細胞內的TG及脂滴含量明顯減少。3.Western-blot結果顯示:抑制SCD1的表達后,可激活原代肝細胞AMPK通路,同時自噬活性增加。4.Western-blot結果顯示:SCD1-OE上調原代肝細胞SCD1蛋白表達的效果明顯,與空白對照組比較明顯增多(p0.05)。5.TG測定及油紅O結果均顯示:過表達SCD1后,原代肝細胞內的TG及脂滴含量明顯增多。6.Western-blot結果顯示:過表達SCD1后,可抑制原代肝細胞AMPK通路,同時自噬活性減弱。三、SCD1通過AMPK調控脂質自噬,影響小鼠原代肝細胞的脂質沉積1.TG測定及油紅O結果均顯示:與PA+Dorsomophin組比較,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組肝細胞內的TG及脂滴含量明顯降低;而與PA+si RNA-SCD1組比較,其含量反而增加(p0.05)。2.Western-blot結果顯示:與PA組比較,PA+Dorsomophin組SCD1蛋白表達量無明顯變化,AMPK活性降低,自噬活性降低。與PA+si RNA-SCD1組比較,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組自噬活性降低;而與PA+Dorsomophin組比較,其活性反而增高(p0.05)。3.透射電鏡結果顯示:PA處理后,原代肝細胞內的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少;單獨抑制SCD1表達后,自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增加。與單獨抑制SCD1表達組比較,同時抑制SCD1表達及AMPK活性組,可使原代肝細胞內增加的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少。4.TG測定及油紅O結果均顯示:與PA+A-769662組比較,PA+SCD1-OE+A-769662組肝細胞內的TG及脂滴含量明顯增加;與PA+SCD1-OE組比較,其含量反而降低(p0.05)。5.Western-blot結果顯示:與PA組比較,PA+A-769662組SCD1蛋白表達量無明顯變化,AMPK活性增加,自噬活性增加。與PA+SCD1-OE組比較,PA+SCD1-OE+A-769662組自噬活性增加;而與PA+A-769662組比較,其活性反而降低(p0.05)。6.透射電鏡結果顯示:單獨增強SCD1表達后,原代肝細胞內的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少;單獨增強AMPK活性后,自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多。與單獨增強SCD1表達組比較,同時增強SCD1表達及AMPK活性組,可使肝細胞內減少的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多。四、抑制體內SCD1表達水平對小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質自噬的影響1.肝功及血脂檢測結果顯示:HFD組小鼠的肝功及血脂水平均明顯高于NCD組,CAY10566組小鼠的肝功及血脂水平均明顯低于HFD組(p0.05)。2.HE染色及油紅O染色結果顯示:HFD組小鼠肝臟組織脂肪變明顯高于NCD組,CAY10566組小鼠肝臟組織脂肪變明顯低于HFD組。3.Western-blot結果顯示:與NCD組小鼠比較,HFD組小鼠肝臟組織中SCD1蛋白表達量明顯增多,同時AMPK活性降低,自噬活性減弱。與HFD組小鼠比較,CAY10566組小鼠肝臟組織中SCD1蛋白表達量明顯降低,同時AMPK活性增加,自噬活性增強。4.透射電鏡結果顯示:NCD組小鼠肝臟組織內有較多的自噬小體及自噬溶酶體分布;HFD組未觀察到自噬小體及自噬溶酶體的分布;CAY10566組較NCD組自噬小體及自噬溶酶體減少,但與HFD組比較明顯增多。結論:PA可誘導小鼠原代肝細胞脂質沉積,同時伴隨SCD1表達增加,AMPK活性減弱,脂質自噬受抑。抑制SCD1表達,可增強AMPK活性,脂質自噬增強,肝細胞中脂質沉積減少;而過表達SCD1,可降低AMPK活性,脂質自噬減弱,肝細胞中脂質沉積增加。SCD1通過抑制AMPK,負性調控脂質自噬,從而影響肝細胞的脂質沉積。抑制體內SCD1的表達可減輕由高脂飲食誘導的小鼠肝臟脂肪變性,增強AMPK活性及脂質自噬。綜上,SCD1-AMPK-脂質自噬通路可作為NAFLD的潛在治療靶點。
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9) 數(shù)據(jù)分析：用 Bio-Rad 凝膠成像儀掃描蛋白條帶光密度值，分析目的蛋白的相對表達含量。1.3 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x ±s）表示，并采用 SPSS17.0 軟件進行處理。采用單因素方差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 小鼠原代肝細胞分離及鑒定如圖 2.1 所示，光鏡下觀察小鼠原代肝細胞貼壁充分，核大而圓，可見肝細胞典型的雙核結構，胞質扁平，展開形成特征的肝島樣結構。經(jīng)糖原染色后，可見胞質內出現(xiàn)大量紫紅色的糖原顆粒。肝細胞特征性抗原 CK-18 免疫熒光染色鑒定，可進一步證實所分離的細胞為小鼠原代肝細胞，且肝細胞純度可達 95%以上。

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文鼠原代肝細胞的最適濃度顯示：使用不用濃度 PA（0、108、180、252、324細胞 24h 后，與對照組比較，當 PA 濃度超過 32P<0.05）。為了降低 PA 對原代肝細胞的毒性作用，濃度，用于后續(xù)實驗。見圖表 2.2。表 2.2 PA 刺激小鼠原代肝細胞的最適濃度able 2.1 The optimal PA concentration for primary hepatoc 108 180 252 324 396 00 98.24 95.73 90.29 85.93*73.26* 1.96 2.49 4.25 3.27 3.18 0μM in primary hepatocyte)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

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1 劉曼;何月;張吉翔;;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對肝星狀細胞增殖活化的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2013年08期

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本文編號：2596102