【摘要】：背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積,且既往無(wú)過(guò)量飲酒史以及其他明確的損肝因素為特征的臨床病理綜合征。NAFLD現(xiàn)在被認(rèn)為是全球慢性肝病最常見的原因,肝內(nèi)脂質(zhì)異常聚集是其發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。因此探索如何阻止脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)異常沉積,對(duì)尋求NAFLD新的防治途徑具有重要意義。硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-Co A desaturase 1,SCD1)參與高脂誘導(dǎo)下肝細(xì)胞脂肪變性,目前相關(guān)機(jī)制研究主要涉及調(diào)控肝細(xì)胞甘油三酯(Triglycerides,TG)合成及脂肪酸氧化。脂質(zhì)自噬被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞脂代謝和脂質(zhì)沉積的一種新機(jī)制,激活肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)自噬,可使肝細(xì)胞免受脂質(zhì)沉積的損傷,在NAFLD中具有保護(hù)性效應(yīng)。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路參與自噬的調(diào)控,同時(shí)又受SCD1水平的影響。前期研究發(fā)現(xiàn),抑制SCD1可激活A(yù)MPK信號(hào)通路,從而增強(qiáng)自噬促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。然而,尚不清楚SCD1是否通過(guò)AMPK調(diào)節(jié)脂質(zhì)自噬參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。鑒于此,本課題首先建立棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導(dǎo)的小鼠原代肝細(xì)胞脂肪變模型,觀察細(xì)胞模型中SCD1與AMPK、脂質(zhì)自噬表達(dá)水平的關(guān)系,然后觀察改變SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積、AMPK及脂質(zhì)自噬的影響,再通過(guò)同時(shí)增強(qiáng)或抑制SCD1的表達(dá)及AMPK活性,探討SCD1是否通過(guò)AMPK調(diào)控脂質(zhì)自噬,影響小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積;在此基礎(chǔ)上,觀察抑制體內(nèi)SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質(zhì)自噬的影響。本研究結(jié)果提示SCD1-AMPK-脂質(zhì)自噬通路可作為NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。方法:一、脂肪肝細(xì)胞模型中SCD1與AMPK、脂質(zhì)自噬表達(dá)水平的關(guān)系1.CCK8法篩選PA刺激小鼠原代肝細(xì)胞的最適濃度。2.PA刺激小鼠原代肝細(xì)胞24h后,用TG酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積情況。3.PA刺激小鼠原代肝細(xì)胞24h后,用Western-blot檢測(cè)SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。二、改變SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積、AMPK及脂質(zhì)自噬的影響1.si RNA-SCD1轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,用Western-blot檢測(cè)SCD1蛋白表達(dá)水平,篩選及驗(yàn)證si RNA-SCD1的沉默效果。2.si RNA-SCD1轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,再用PA刺激肝細(xì)胞24h。原代肝細(xì)胞分為4組:對(duì)照組,si RNA-SCD1組,PA刺激組,PA+si RNA-SCD1組。用TG酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積情況。3.用Western-blot檢測(cè)上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)的SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。4.SCD1過(guò)表達(dá)腺病毒(SCD1 overexpression adenoviruse,SCD1-OE)感染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,用Western-blot檢測(cè)SCD1蛋白表達(dá)水平,驗(yàn)證SCD1-OE的過(guò)表達(dá)效果。5.SCD1-OE感染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,再用PA刺激肝細(xì)胞24h。原代肝細(xì)胞分為4組:對(duì)照組,SCD1-OE組,PA刺激組,PA+SCD1-OE組。用TG酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積情況。6.用Western-blot檢測(cè)上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)的SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。三、SCD1通過(guò)AMPK調(diào)控脂質(zhì)自噬,影響小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積1.si RNA-SCD1轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,再用PA刺激細(xì)胞24h和AMPK抑制劑Dorsomophin刺激細(xì)胞2h。原代肝細(xì)胞分為8組:對(duì)照組,si RNA-SCD1組,Dorsomophin組,si RNA-SCD1+Dorsomophin組,PA刺激組,PA+si RNA-SCD1組,PA+Dorsomophin組,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組。用TG酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積情況。2.用Western-blot檢測(cè)上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)的SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。3.透射電鏡觀察上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。4.SCD1-OE感染小鼠原代肝細(xì)胞48h后,再用PA刺激細(xì)胞24h和AMPK激動(dòng)劑A-769662刺激細(xì)胞2h。原代肝細(xì)胞分為8組:對(duì)照組,SCD1-OE組,A-769662組,SCD1-OE+A-769662組,PA刺激組,PA+SCD1-OE組,PA+A-769662組,PA+si RNA-SCD1+A-769662組。用TG酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)TG含量,油紅O染色檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積情況。5.用Western-blot檢測(cè)上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)的SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。6.透射電鏡觀察上述各組原代肝細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。四、抑制體內(nèi)SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質(zhì)自噬的影響1.小鼠分為3組:正常飼料組(normal chow diet group,NCD),高脂飼料組(high fat diet group,HFD),CAY10566處理組(高脂飼料聯(lián)合SCD1抑制劑CAY10566腹腔注射)。3組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)14周,建模完成。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠的肝功能及血脂水平。2.HE染色及油紅O染色檢測(cè)各組小鼠肝臟的脂肪變情況。3.Western-blot檢測(cè)各組小鼠肝臟的SCD1、AMPK、自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)。4.透射電鏡觀察小鼠肝臟組織內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體的分布情況。結(jié)果:一、脂肪肝細(xì)胞模型中SCD1與AMPK、脂質(zhì)自噬表達(dá)水平的關(guān)系1.CCK8結(jié)果顯示:324μM是PA刺激小鼠原代肝細(xì)胞的最適終濃度。2.TG測(cè)定及油紅O結(jié)果均顯示:與對(duì)照組相比,PA刺激原代肝細(xì)胞細(xì)胞后,TG含量及脂滴含量均明顯升高(p0.05)。3.Western-blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,PA刺激組SCD1蛋白表達(dá)量明顯增高,p-AMPK/t-AMPK比值降低,自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)量增高,LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例降低,(p0.05)。二、改變SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積、AMPK以及脂質(zhì)自噬的影響1.Western-blot結(jié)果顯示:si RNA-SCD1-414下調(diào)原代肝細(xì)胞SCD1蛋白表達(dá)的效果最明顯,與空白對(duì)照組比較明顯減少(p0.05)。2.TG測(cè)定及油紅O結(jié)果均顯示:抑制SCD1的表達(dá)后,原代肝細(xì)胞內(nèi)的TG及脂滴含量明顯減少。3.Western-blot結(jié)果顯示:抑制SCD1的表達(dá)后,可激活原代肝細(xì)胞AMPK通路,同時(shí)自噬活性增加。4.Western-blot結(jié)果顯示:SCD1-OE上調(diào)原代肝細(xì)胞SCD1蛋白表達(dá)的效果明顯,與空白對(duì)照組比較明顯增多(p0.05)。5.TG測(cè)定及油紅O結(jié)果均顯示:過(guò)表達(dá)SCD1后,原代肝細(xì)胞內(nèi)的TG及脂滴含量明顯增多。6.Western-blot結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)SCD1后,可抑制原代肝細(xì)胞AMPK通路,同時(shí)自噬活性減弱。三、SCD1通過(guò)AMPK調(diào)控脂質(zhì)自噬,影響小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積1.TG測(cè)定及油紅O結(jié)果均顯示:與PA+Dorsomophin組比較,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組肝細(xì)胞內(nèi)的TG及脂滴含量明顯降低;而與PA+si RNA-SCD1組比較,其含量反而增加(p0.05)。2.Western-blot結(jié)果顯示:與PA組比較,PA+Dorsomophin組SCD1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,AMPK活性降低,自噬活性降低。與PA+si RNA-SCD1組比較,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin組自噬活性降低;而與PA+Dorsomophin組比較,其活性反而增高(p0.05)。3.透射電鏡結(jié)果顯示:PA處理后,原代肝細(xì)胞內(nèi)的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少;單獨(dú)抑制SCD1表達(dá)后,自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增加。與單獨(dú)抑制SCD1表達(dá)組比較,同時(shí)抑制SCD1表達(dá)及AMPK活性組,可使原代肝細(xì)胞內(nèi)增加的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少。4.TG測(cè)定及油紅O結(jié)果均顯示:與PA+A-769662組比較,PA+SCD1-OE+A-769662組肝細(xì)胞內(nèi)的TG及脂滴含量明顯增加;與PA+SCD1-OE組比較,其含量反而降低(p0.05)。5.Western-blot結(jié)果顯示:與PA組比較,PA+A-769662組SCD1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,AMPK活性增加,自噬活性增加。與PA+SCD1-OE組比較,PA+SCD1-OE+A-769662組自噬活性增加;而與PA+A-769662組比較,其活性反而降低(p0.05)。6.透射電鏡結(jié)果顯示:單獨(dú)增強(qiáng)SCD1表達(dá)后,原代肝細(xì)胞內(nèi)的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少;單獨(dú)增強(qiáng)AMPK活性后,自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多。與單獨(dú)增強(qiáng)SCD1表達(dá)組比較,同時(shí)增強(qiáng)SCD1表達(dá)及AMPK活性組,可使肝細(xì)胞內(nèi)減少的自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多。四、抑制體內(nèi)SCD1表達(dá)水平對(duì)小鼠肝臟脂肪變性、AMPK以及脂質(zhì)自噬的影響1.肝功及血脂檢測(cè)結(jié)果顯示:HFD組小鼠的肝功及血脂水平均明顯高于NCD組,CAY10566組小鼠的肝功及血脂水平均明顯低于HFD組(p0.05)。2.HE染色及油紅O染色結(jié)果顯示:HFD組小鼠肝臟組織脂肪變明顯高于NCD組,CAY10566組小鼠肝臟組織脂肪變明顯低于HFD組。3.Western-blot結(jié)果顯示:與NCD組小鼠比較,HFD組小鼠肝臟組織中SCD1蛋白表達(dá)量明顯增多,同時(shí)AMPK活性降低,自噬活性減弱。與HFD組小鼠比較,CAY10566組小鼠肝臟組織中SCD1蛋白表達(dá)量明顯降低,同時(shí)AMPK活性增加,自噬活性增強(qiáng)。4.透射電鏡結(jié)果顯示:NCD組小鼠肝臟組織內(nèi)有較多的自噬小體及自噬溶酶體分布;HFD組未觀察到自噬小體及自噬溶酶體的分布;CAY10566組較NCD組自噬小體及自噬溶酶體減少,但與HFD組比較明顯增多。結(jié)論:PA可誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積,同時(shí)伴隨SCD1表達(dá)增加,AMPK活性減弱,脂質(zhì)自噬受抑。抑制SCD1表達(dá),可增強(qiáng)AMPK活性,脂質(zhì)自噬增強(qiáng),肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積減少;而過(guò)表達(dá)SCD1,可降低AMPK活性,脂質(zhì)自噬減弱,肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積增加。SCD1通過(guò)抑制AMPK,負(fù)性調(diào)控脂質(zhì)自噬,從而影響肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。抑制體內(nèi)SCD1的表達(dá)可減輕由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性,增強(qiáng)AMPK活性及脂質(zhì)自噬。綜上,SCD1-AMPK-脂質(zhì)自噬通路可作為NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

9) 數(shù)據(jù)分析：用 Bio-Rad 凝膠成像儀掃描蛋白條帶光密度值，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，并采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行處理。采用單因素方差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離及鑒定如圖 2.1 所示，光鏡下觀察小鼠原代肝細(xì)胞貼壁充分，核大而圓，可見肝細(xì)胞典型的雙核結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)扁平，展開形成特征的肝島樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)糖原染色后，可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量紫紅色的糖原顆粒。肝細(xì)胞特征性抗原 CK-18 免疫熒光染色鑒定，可進(jìn)一步證實(shí)所分離的細(xì)胞為小鼠原代肝細(xì)胞，且肝細(xì)胞純度可達(dá) 95%以上。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文鼠原代肝細(xì)胞的最適濃度顯示：使用不用濃度 PA（0、108、180、252、324細(xì)胞 24h 后，與對(duì)照組比較，當(dāng) PA 濃度超過(guò) 32P<0.05）。為了降低 PA 對(duì)原代肝細(xì)胞的毒性作用，濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖表 2.2。表 2.2 PA 刺激小鼠原代肝細(xì)胞的最適濃度able 2.1 The optimal PA concentration for primary hepatoc 108 180 252 324 396 00 98.24 95.73 90.29 85.93*73.26* 1.96 2.49 4.25 3.27 3.18 0μM in primary hepatocyte)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉曼;何月;張吉翔;;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖活化的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年08期

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本文編號(hào)：2596102