【摘要】： 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中SLC所致淋巴細胞異常歸巢的機制 背景及目的 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是胃腸道最嚴重的疾病之一,其發(fā)病機制一般認為涉及到遺傳、免疫、感染等多方面的因素。其中免疫因素在發(fā)病中的作用已經(jīng)得到肯定,目前并不清楚這種過度亢進的免疫反應(yīng)是特異的抗原持續(xù)刺激抑或免疫調(diào)節(jié)異常所致,但UC的免疫異常發(fā)病機制中都有淋巴細胞異常歸巢這一相同的病理特性。淋巴細胞異常歸巢是UC發(fā)生過程中免疫紊亂的主要表現(xiàn)之一,也是發(fā)生腸黏膜損傷的主要原因。次級淋巴趨化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的趨化因子之一,是目前認為第一參與體內(nèi)淋巴細胞歸巢的趨化因子,但是SLC在潰瘍性結(jié)腸炎腸道淋巴細胞異常歸巢時作用途徑和作用通道究竟如何,國內(nèi)外尚未見報道。為此,本次實驗首先擬以不同濃度2.4-二硝基氯苯丙酮液(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)灌腸液建立大鼠UC模型,探索最佳造模液濃度。建立理想的大鼠UC模型后,了解典型大鼠UC模型中淋巴細胞異常歸巢現(xiàn)象,SLC及相關(guān)黏附分子表達量的變化,闡明淋巴細胞異常歸巢與UC炎癥反應(yīng)的關(guān)系;應(yīng)用SLC抗體干預(yù)UC動物模型,觀測淋巴細胞歸巢及UC炎癥的發(fā)病情況,來明確SLC在UC發(fā)病中作用,進一步通過體外淋巴細胞培養(yǎng),了解SLC對淋巴細胞歸巢的作用機制及途徑。 方法 1.造模方法:將80只SD大鼠隨機分為對照組、大、中、小劑量模型組,致敏后分別予以丙酮、20%、10%、6%DNCB灌腸液灌腸造模,觀察造模后大鼠的生存狀況;結(jié)腸病理變化;結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)評分;ELISA法檢測結(jié)腸組織中細胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)。 2.體內(nèi)實驗:將60只SD大鼠分為對照組、模型組及SLC干預(yù)組(干預(yù)組)各20只,干預(yù)組大鼠在灌腸造模時開始每日自鼠尾靜脈注入SLC抗體(15μg/ml/kg)×5day,切片觀測各組大鼠腸粘膜下perye淋巴結(jié)大小及腸粘膜炎癥的變化(HE染色病理切片、細胞因子IL-2、IL-6等);RT-PCR及westen-blot法檢測腸黏膜SLC及相關(guān)黏附分子α4β7表達量的變化;免疫組織化學(xué)法定位檢測SLC。 3.體外實驗:抽取模型組及對照組門靜脈血,分離淋巴細胞并培養(yǎng),利用BOYDEN小室作SLC對淋巴細胞的趨化實驗;流式細胞儀檢測淋巴細胞表面的黏附分子α4、β7的表達變化;westen—blot法檢測模型組及對照組淋巴細胞胞漿、胞核中核因子NF-κB-p65的表達情況。 結(jié)果: 1.造模情況:形態(tài)學(xué)觀察和病理切片觀察造模大鼠病變腸粘膜與人腸炎癥性病變相似,大、中、小劑量DNCB均能成功造模,大、中劑量DNCB造模成功后,癥狀持續(xù)時間較長,但動物全身反應(yīng)重、死亡率高,小劑量組局部癥狀典型,類似UC,死亡率低,但癥狀持續(xù)時間相對較短;造模后第5d(D5)、第14d(D14)、第28d(D28)檢測小劑量組、中劑量組及大劑量組的結(jié)腸組織中的細胞因子IL-2結(jié)果分別為:D5 230±52 280±42 290±39;D14 210±36 270±45280±43;D28 140±28 185±38 190±32(單位:pg/ml);小劑量組與中、大劑量組相比有統(tǒng)計學(xué)差異,組織細胞因子IFN-γ、IL-6亦有相似變化。 2.體內(nèi)實驗:模型組、干預(yù)組大鼠均有異常淋巴細胞歸巢現(xiàn)象,peyer's淋巴結(jié)增生,切片perye淋巴結(jié)截面積定量比較顯示:模型組、干預(yù)組與對照組相比,[9.56±0.32;5.84±0.62 vs 1.48±0.58,p＜0.01];模型組與干預(yù)組相比,[9.56±0.32 vs 5.84±0.62,p＜0.05]其間均有明顯差異;模型組結(jié)腸SLC mRNA的表達量與對照組相比明顯升高,(0.846±0.07 vs 0.312±0.12,p＜0.01),干預(yù)組中SLCmRNA也明顯高表達,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(0.768±0.135 vs0.312±0.12,p＜0.01)但模型組與干預(yù)組之間差別無顯著性(0.846±0.047 vs0.768±0.135,p＞0.05);模型組、干預(yù)組大鼠結(jié)腸SLC蛋白的表達量與對照組相比明顯升高,(0.937±0.143,0.804±0.215 vs 0.532±0.201,p＜0.01);但模型組與干預(yù)組相比(0.937±0.143 vs 0.804±0.215,p＞0.05)模型組與干預(yù)組之間差別無顯著性。SLC定位顯示表達于粘膜下高內(nèi)皮微靜脈內(nèi)皮細胞的表面,與正常組相比,模型組、干預(yù)組SLC的內(nèi)皮細胞著色陽性數(shù)有差異,p＜0.01。比較淋巴細胞歸巢相關(guān)黏附分子α4、β7的變化,模型組與干預(yù)組之間無差異(0.772±0.108 vs0.725±0.013~◆p＞0.05),但它們與正常組之間差別有高度統(tǒng)計學(xué)意義(0.772±0.108;0.725±0.013vs0.418±0.025~*p＜0.01);UC模型大鼠炎癥粘膜中IL-2和IL-6的濃度與SLC抗體干預(yù)組比較,差異顯著[(353.6±25.7)pg/ml vs(133.1±31.2)pg/ml,p＜0.05];[(441.6±22.5)pg/ml vs(145.8±28.9)pg/ml,p＜0.01]。 3.體外實驗:SLC趨化刺激可提高淋巴細胞的移行反應(yīng)增高3.7倍,SLC的中和抗體可逆轉(zhuǎn)SLC的這種性能(54.4%),SLC可誘導(dǎo)淋巴細胞的移行反應(yīng),并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,但存在飽和現(xiàn)象;模型組中淋巴細胞表面的黏附分子α4(64.58±9.73 vs 16.62±7.84,p＜0.01);β7(56.76±16.13 vs12.93±6.53,p＜0.01)表達量明顯升高,模型組、對照組的胞漿NF-κB-p65westen-blot表達結(jié)果顯示:模型組、對照組都表現(xiàn)為較強表達,模型組表達更高(0.84±0.04 vs 0.75±0.11,p＞0.05)。胞核NF-κB-p65 westen-blot表達結(jié)果顯示:模型組為強表達,對照組弱表達(0.94±0.34 vs 0.41±0.02,p＜0.05),有顯著性差異,模型組的NF-κB-p65活性系數(shù)明顯高于對照組(1.19±0.43 vs 0.60±0.56,p＜0.01)。 結(jié)論: 1.DNCB造模為免疫遲發(fā)過敏反應(yīng)的模型,可有較重全身反應(yīng),6%DNCB丙酮灌腸液可作為最佳濃度對致敏大鼠造模,死亡率低,局部癥狀典型,類似UC發(fā)病,有可一次成批造模,人工可控,模型時間長等優(yōu)點 2.UC病變時存在腸粘膜下淋巴細胞異常歸巢現(xiàn)象,炎癥腸組織中SLC、黏附分子α4β7表達量明顯升高,SLC主要表達于粘膜下層的微血管區(qū),SLC抗體干預(yù)后炎癥病變減輕。 3.SLC對淋巴細胞有較強的趨化作用,黏附分子α4β7是淋巴細胞的歸巢受體,淋巴細胞激活后胞內(nèi)NF-κB被激活,進而促進有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)、細胞因子、黏附分子的產(chǎn)量,導(dǎo)致UC炎癥粘膜的損傷。
【圖文】：

實驗結(jié)果狀60只模型組大鼠，蘇醒后均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、少飲食減少等改變、進而在l一3d內(nèi)出現(xiàn)大便次數(shù)增多、軟便或粘液或膿點等表現(xiàn)，少數(shù)有血性腹瀉、毛發(fā)無光澤、體重下狀嚴重而死亡(不同組別大鼠的死亡數(shù)及時間見表2);正常反應(yīng)靈活、飲食量正常、均無腹瀉及血便，體重由190一21009。

粘膜結(jié)構(gòu)進一步消失，絨毛脫落，PP明顯增生圖1不同組別大鼠粘膜下PP淋巴結(jié)細胞不斷地從毛細血管后微靜脈遷移至組織，然后通過淋巴循環(huán)再，這個過程稱為淋巴細胞再循環(huán)(l丫rnphocyterecirculation)。淋巴移至淋巴器官及組織，又稱為淋巴細胞歸巢(l丫rnphocytehaming)。細胞歸巢至淋巴組織和非淋巴組織及向炎癥部位的滲出等。腸道粘原侵入機體的主要部位之一，位于腸上皮細胞之間的M細胞可以從抗原，然后轉(zhuǎn)移至粘膜下的派伊爾小節(jié)(peyer’5Patches，，pp)，淋是正常腸粘膜的免疫保護現(xiàn)象。在pp內(nèi)，抗原經(jīng)有效處理后呈遞血液中的淋巴細胞經(jīng)高內(nèi)皮后微靜脈(highendothelialvenules，HE從而誘發(fā)免疫反應(yīng)。由此，派伊爾小節(jié)可作為uc發(fā)病時觀察淋巴細象的重要結(jié)構(gòu)。為此:我們計算了不同組別同一條件下(200*)粘結(jié)的截面積，比較SLC對淋巴細胞歸巢的影響。組別HE切片粘膜下PP淋巴結(jié)的截面積(陌2)
【學(xué)位授予單位】：同濟大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R574.62

【引證文獻】

相關(guān)會議論文 前1條

1 趙琛;馬金丹;殷之光;劉世敏;;針灸對實驗性腸炎模型大鼠結(jié)腸CCR7、SLC及外周血TNF-α的影響[A];2011中國針灸學(xué)會年會論文集（摘要）[C];2011年

本文編號：2595840