【摘要】：肝臟缺血再灌注損傷（Hepatic ischemiareperfusion injury，I/R）是指肝臟組織缺血一段時間后恢復血液灌注，不但不能使其原有功能和結構得以恢復，反而更為加重其功能障礙和結構損傷的現(xiàn)象。肝臟缺血再灌注損傷在肝臟外科疾病中是最為常見的一種病理過程，常見于肝臟移植、肝臟腫瘤切除術、肝外傷及失血性休克等，可引起嚴重的肝臟及其他器官功能的衰竭，也是手術失敗和導致患者死亡的重要原因之一。因此探討肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程及對其產生保護作用的相關因素及分子機理，揭示其發(fā)生發(fā)展及保護作用的精確分子機制、尋找能夠預防和治療肝臟缺血再灌注損傷的新型藥物，對進一步提高我國肝臟疾病的治療水平具有重要意義。 手術治療是目前治療原發(fā)性和繼發(fā)性肝腫瘤的最佳手段，由于肝臟復雜的血管分布和豐富的血流供應，使得肝臟手術中極難控制出血。越來越多臨床實踐證實，術中大量輸血可能導致術后病死率、并發(fā)癥發(fā)生率增高及肝癌患者長期生存率降低。所以，術中阻斷肝臟供血對于減少術中出血有著很重要的作用。目前術中阻斷入肝血流的方法最常用的是肝蒂阻斷法(Pringle法)，可有效的控制術中發(fā)生的出血，但同時肝組織缺血再灌注損傷的發(fā)生率較高，甚至導致術后肝功能衰竭等嚴重并發(fā)癥。如何根據(jù)病情合理的選擇肝血供的阻斷方式對于患者術后肝功能恢復有著很重要的影響。因此，選擇性入肝血流阻斷，包括半肝阻斷、區(qū)域阻斷以及單純門靜脈阻斷等方法不僅有效減少術中出血，而且非常有助于術后肝功能的恢復。 環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，，COX)是催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）合成前列腺素（Prostaglandin，PG）和血栓素（Thromboxane，TX）的關鍵限速酶。COX通常以兩種亞型存在于組織中。COX-1為結構型，存在于大多數(shù)組織中，催化生成維持正常生理功能所需要的前列腺素；COX-2為誘導型，在正常情況下大多數(shù)的組織中表達極低，但是在炎癥、腫瘤、缺血再灌注等過程中表達明顯增加。有研究表明，COX-2參與了缺血后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展，并與腦缺血的預后關系密切。 塞來昔布（Celecoxib）是一種選擇性的COX-2抑制劑，化學名為4-[5-（甲苯基）-3-（三氟甲基）-1-H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，它能抑制COX-2的高表達，從而抑制花生四烯酸的代謝產物PGI2與TXA2的比例（TXA2/PGI2）水平失衡，減輕炎癥反應，改善微循環(huán)，減輕組織損傷和細胞水腫，從而減少肝臟I/R的程度。臨床上主要用于骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎的治療，在腦缺血再灌注的研究表明其可能通過降低腦組織中TXA2/PGI2的比值，減輕炎癥反應，改善微循環(huán)，減輕腦損傷和腦水腫，且可減少氧自由基的產生，提高SOD活性從而發(fā)揮腦保護作用。目前關于COX-2對缺血再灌注的直接作用研究主要還是集中在COX-2對腦缺血再灌注損傷等領域，而關于COX-2對肝臟缺血再灌注損傷的研究還比較少，許多問題還未得到徹底闡明。本實驗在建立的大鼠肝臟的缺血再灌注模型中加用不同劑量塞來昔布來抑制COX-2的活性，通過測定各組大鼠缺血灌注后肝臟中COX-2、p-Stat3（pTry705）等的表達水平，進一步探討塞來昔布在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其詳細機制。 目的：1.觀察不同阻斷方式對肝臟I/R的影響。2.觀察塞來昔布對大鼠肝臟I/R的影響及作用機制。 方法：1.選用健康雄性SD大鼠60只，隨機分為2組(n=30)，分別為：單純門靜脈阻斷組（A組）：充分暴露肝門部，仔細分離左、中肝的肝蒂，小心剝離其表面的Glisson鞘和膽管，分離門靜脈與肝動脈，用無損傷動脈夾夾閉左、中門靜脈分支，同時保留左、中肝動脈及右肝血供。肝蒂阻斷組（B組）：充分暴露肝門部，分離肝左、中葉的門靜脈、肝動脈及膽管，用無損傷動脈夾夾閉整個左、中肝肝蒂。兩組均夾閉60min，恢復血流后于1、3、6、12、24h取血液標本檢測ALT、AST的濃度；取肝臟組織標本檢測MDA、MPO的濃度。2.選用健康雄性SD大鼠30只，隨機分為5組(n=6)，分別為：Ⅰ組（對照組）：開腹阻斷門靜脈和肝動脈后給予生理鹽水灌胃；Ⅱ組（假手術組）：開腹未阻斷門靜脈和肝動脈，關腹；Ⅲ組（低劑量塞來昔布組）：開腹阻斷門靜脈和肝動脈后給予塞來昔布10mg/kg灌胃；Ⅳ組（中劑量塞來昔布組）：開腹阻斷門靜脈和肝動脈后給予塞來昔布20mg/kg灌胃；Ⅴ組（高劑量塞來昔布組）：開腹阻斷門靜脈和肝動脈后給予塞來昔布40mg/kg灌胃。各組均夾閉肝蒂30min后開放6小時，取血液標本檢測ALT、AST的濃度，以確定肝臟缺血再灌注后損傷高峰時相和塞來昔布的保護作用；取肝臟組織標本檢測MDA、MPO的濃度；通過HE染色方法觀察肝臟損傷的情況；Western blot方法檢測COX-2、STAT3及p-Stat3（pTry705）在肝臟組織中的表達水平。 結果：1.通過監(jiān)測大鼠體內ALT、AST、MDA及MPO的濃度，我們發(fā)現(xiàn)，與肝蒂阻斷組比較，單純門靜脈阻斷組血液內ALT和AST的濃度均明顯下降（P0.05），同時，單純門靜脈阻斷組血液內MDA和MPO的濃度均明顯低于肝蒂阻斷組（P0.05）。2.通過監(jiān)測大鼠體內ALT、AST、MDA及MPO的濃度，我們發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，對照組血液內ALT和AST的濃度均明顯升高（P0.05），與對照組比較，不同濃度的塞來昔布組的ALT和AST的濃度均有所下降，其中以中劑量塞來昔布組最為明顯（P0.05）；同時，與假手術組比較，對照組血液內MDA和MPO的濃度均明顯升高（P0.05），與對照組比較，不同濃度的塞來昔布組的MDA和MPO的濃度均有所下降（P0.05），其中以中劑量塞來昔布組最為明顯，提示再灌注后6小時肝臟損傷明顯，而塞來昔布可逆轉肝臟的缺血再灌注損傷。HE染色發(fā)現(xiàn)假手術組僅見少量細胞水腫，肝小葉結構基本正常；而對照組肝血竇充血、擴張明顯，肝臟細胞水腫明顯，細胞核深染，可見少量片狀壞死；塞來昔布處理組見部分肝細胞水腫，核深染，可見點狀細胞壞死，匯管區(qū)輕度擴張，偶有少量充血，其中，中劑量組肝臟細胞損傷程度較低。Westernblot法檢測COX-2、STAT3及p-Stat3（pTry705）的表達水平發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，對照組COX-2及p-Stat3（pTry705）的表達水平均明顯升高（P0.05），與對照組比較，不同濃度的塞來昔布組COX-2及p-Stat3（pTry705）的表達水平均下降，其中以中劑量塞來昔布組最為明顯（P0.05）；STAT3在各實驗組中的表達水平并無明顯變化，提示塞來昔布對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用與COX-2及p-Stat3相關。 結論： 1.區(qū)域阻斷血供切肝術是一種安全的手術方式，可以有效的減少患者術中肝臟的損傷以及利于術后肝功能的恢復。 2.單純門靜脈阻斷的大鼠肝臟缺血再灌注損傷比肝蒂阻斷的大鼠較輕，其機理可能與再灌注后脂質過氧化反應和中性粒細胞浸潤有關。 3.塞來昔布可降低ALT、AST及MDA、MPO的表達水平從而對肝臟缺血再灌注損傷起到保護作用，并且以中等劑量（20mg/kg）效果較好。 4.塞來昔布對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用可能與COX-2、 p-Stat3（pTry705）的表達下降相關。
【圖文】：

結 果LT、AST 檢測結果我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，未處理大鼠血清中 ALT 含量為 37.83±4.31，AST 含量為 96.33±22.66。單純門靜脈阻斷 30 min 再灌注 1、3、6、12、24 h 大鼠血清中 ALT含 量 分 別 為 298.83±54.06 、 476.83±47.27 、 664.00±125.73 、 902.00±166.78 、88.17±19.53 ， AST 含量分別為 425.00±21.75 、 776.17±84.42、 974.83±103.38 、1250.00±237.67、456.17±87.59。肝蒂阻斷 30 min 再灌注 1、3、6、12、24 h 大鼠血 清 中 ALT 含 量 分 別 為 474.50±59.30 、 856.33±43.67 、 1147.17±209.12 、1948.33±181.25、291.83±59.32，AST 含量分別為 959.83±118.05、1291.00±193.63、2092.83±398.09、2961.50±295.93、768.00±107.99。不同時間點單純門靜脈阻斷組的 ALT、AST 含量均低于肝蒂阻斷組（p＜0.05）。（結果見圖 1, 2）。

圖 2 各組大鼠血清 AST 檢測結果，數(shù)據(jù)來自三次獨立的實驗。2. 肝組織 MDA 檢測結果各組大鼠經不同處理后，取肝臟組織進行 MDA 檢測，結果發(fā)現(xiàn)，未處理大鼠肝組織中 MDA 含量為 1.228±0.091。單純門靜脈阻斷 60min 再灌注 1、3、6、12、24h 大鼠肝臟組織中的 MDA 含量分別為 1.416±0.127、1.797±0.088、2.271±0.103、2.919±0.075、1.559±0.081。肝蒂阻斷 60min 再灌注 1、3、6、12、24h 大鼠肝臟組織中的 MDA 含量分別為 1.722±0.137、2.167±0.136、2.840±0.117、3.674±0.091、1.759±0.127。不同時間點單純門靜脈阻斷組大鼠肝臟組織中的 MDA 含量均低于肝蒂阻斷組（p＜0.05）。（結果見圖 3）。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：2595454