【摘要】：慢加急性肝衰竭是臨床常見(jiàn)急危重癥之一,病死率很高,其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,迄今尚無(wú)理想的治療方法。有研究報(bào)道腸源性內(nèi)毒素血癥在肝衰竭發(fā)病過(guò)程中起重要作用,而高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為晚期炎癥介質(zhì),參與了內(nèi)毒素血癥發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。因此推測(cè)HMGB1可能在慢加急性肝衰竭(ACLF)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。本文試圖通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),觀察HMGB1拮抗劑正丁酸鈉對(duì)慢加急性肝衰竭的治療效果,探討拮抗HMGB1表達(dá)對(duì)慢加急性肝衰竭的保護(hù)作用及其機(jī)制,旨在為臨床治療慢加急性肝衰竭提供理論研究,研究共分為四個(gè)部分。 第一部分：慢加急性肝衰竭大鼠模型的建立 目的：建立穩(wěn)定的慢加急性肝衰竭大鼠模型。方法：應(yīng)用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖等藥物聯(lián)合誘導(dǎo)方法,構(gòu)建ACLF大鼠模型,觀察大鼠模型的組織學(xué)及病理生理學(xué)改變特點(diǎn)。結(jié)果：應(yīng)用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖等藥物聯(lián)合誘導(dǎo)6周,觀察結(jié)果顯示,模型組大鼠的肝組織學(xué)檢查可見(jiàn)假小葉、廣泛肝細(xì)胞變性、以及融合性壞死和橋接壞死等典型改變,并伴有肺、腎及腸道粘膜組織的病理?yè)p傷,同時(shí)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素y(IFN-y)、 HMGB1等也伴有相應(yīng)升高,呈現(xiàn)慢加急性肝衰竭的組織學(xué)和病理生理學(xué)改變特點(diǎn)。結(jié)論：該大鼠模型與臨床常見(jiàn)的ACLF病理學(xué)改變特點(diǎn)相似,穩(wěn)定性較好。 第二部分：正丁酸鈉對(duì)慢加急性肝衰竭大鼠的保護(hù)作用 目的：觀察正丁酸鈉(sodium bucyrate)對(duì)大鼠慢加急性肝衰竭的保護(hù)作用。方法：應(yīng)用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖建立ACLF大鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組及正丁酸鈉治療組。治療組大鼠在誘導(dǎo)ACLF模型后第12h和24h時(shí)間點(diǎn),分別給予正丁酸鈉(500mg/kg)治療。檢測(cè)血清HMGB1、腫瘤壞死因子α(TNF-a)、干擾素γ(IFN-y)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、及總膽紅素(TBIL)水平。觀察肝組織病理學(xué)變化。檢測(cè)肝組織中HMGB1mRNA表達(dá)及HMGB1蛋白、NF-κB p65蛋白水平。觀察正丁酸鈉對(duì)ACLF大鼠生存時(shí)間和生存率的影響。結(jié)果：模型組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IFN-γ、ALT、AST及TBIL均顯著升高,并且呈現(xiàn)嚴(yán)重的肝組織病理學(xué)損傷,伴有廣泛肝細(xì)胞變性壞死。正丁酸鈉治療組不論12h或24h時(shí)間點(diǎn),肝組織學(xué)損傷較模型組均顯著改善,并且血清HMGB1、TNF-α IFN-γ、 ALT、AST及TBIL水平明顯降低,肝組織中HMGB1蛋白及NF-κB p65蛋白表達(dá)減少,大鼠生存時(shí)間較模型組顯著延長(zhǎng)(P0.05)。結(jié)論：正丁酸鈉通過(guò)抑制HMGB1表達(dá),控制NF-κB活性,降低炎癥因子水平,減輕肝細(xì)胞損傷,提高模型大鼠存活率,提示正丁酸鈉有較好的保肝作用。 第三部分：正丁酸鈉對(duì)慢加急性肝衰竭大鼠腸粘膜通透性的影響 目的：探討正丁酸鈉對(duì)慢加急性肝功能衰竭大鼠腸道粘膜通透性的影響。方法：應(yīng)用人血白蛋白、脂多糖以及D-氨基半乳糖等藥物聯(lián)合誘導(dǎo),建立慢加急性肝功能衰竭大鼠模型,并用正丁酸鈉進(jìn)行治療。觀察小腸粘膜病理學(xué)改變以及腸道粘膜通透性(FD4)變化。檢測(cè)血清內(nèi)毒素(LPS)、D-乳酸(D-lactate)、二胺氧化酶(DAO)、HMGB1、TNF-α、IFN-γ水平。結(jié)果：模型組大鼠的腸粘膜損傷程度和腸粘膜通透性明顯異常,而經(jīng)正丁酸鈉治療組,無(wú)論在第12h或24h時(shí)間點(diǎn),大鼠的腸道病理?yè)p傷均較模型組明顯減輕,小腸粘膜通透性(FD4)較模型組降低(P0.05)。血清內(nèi)毒素、D-乳酸、DAO、HMGB1、TNF-α和IFN-γ水平也較模型組明顯降低(P0.05)。結(jié)論：正丁酸鈉能夠降低腸道粘膜通透性,降低血清內(nèi)毒素及炎癥因子釋放水平,對(duì)慢加急性肝衰竭大鼠的腸道粘膜屏障具有保護(hù)作用。 第四部分：正丁酸鈉對(duì)Caco-2(?)田胞分泌高遷移率族蛋白B1的影響 目的：探討正丁酸鈉對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞分泌HMGB1的影響及其作用機(jī)制。方法：選擇Caco-2細(xì)胞為研究對(duì)象,以U937細(xì)胞作為對(duì)照,在不同時(shí)間點(diǎn)、采用不同劑量脂多糖(LPS)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,并應(yīng)用正丁酸鈉進(jìn)行干預(yù)。觀察細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡變化。檢測(cè)培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白水平及細(xì)胞內(nèi)HMGB1mRNA、HMGB1蛋白以及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。觀察HMGB1蛋白在腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)的分泌和移位。結(jié)果：應(yīng)用LPS刺激后,在24h內(nèi)細(xì)胞存活率較高,于48h時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)明顯壞死或凋亡。在24h和48h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)有較弱HMGB1mRNA表達(dá)。應(yīng)用LPS刺激后,Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中于12h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到HMGB1蛋白,晚于免疫細(xì)胞U937細(xì)胞(6h),表達(dá)量也低于U937細(xì)胞,并且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加,呈時(shí)間依賴性(P0.05)。經(jīng)量子點(diǎn)超敏免疫熒光標(biāo)記后觀察發(fā)現(xiàn),在12h時(shí)間點(diǎn),Caco-2細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)HMGB1胞漿移位,隨時(shí)間延長(zhǎng)紅色熒光逐漸增強(qiáng)。經(jīng)western blotting證實(shí),在12h時(shí)間點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)水平開(kāi)始增加。在24h時(shí)間點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平開(kāi)始增加。應(yīng)用正丁酸鈉拮抗后,Caco-2細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白水平明顯降低,胞漿移位減少(P0.05)。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)p65蛋白表達(dá)水平也隨之下降。結(jié)論：腸粘膜上皮細(xì)胞Caco-2在LPS刺激下,可以分泌HMGB1,并且分泌時(shí)相晚于免疫細(xì)胞U937,分泌量也較少。該分泌過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)HMGB1的胞漿移位有關(guān),且可以被HMGB1拮抗劑正丁酸鈉所抑制。提示HMGB1參與了腸粘膜上皮細(xì)胞的損傷過(guò)程,與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān),可能是炎癥早期造成腸粘膜通透性升高的原因之一。正丁酸鈉可能通過(guò)抑制NF-kB通路活性發(fā)揮抗炎作用。
【圖文】：

圖1.1肝臟人體形態(tài)學(xué)、HE染色(X400)及Masson染色結(jié)果(X400).A:正常組；B:對(duì)照組；C:模？？彳組。1:人體形態(tài)學(xué)；2: HE染色；3: Masson染色。正常組(A)外觀形態(tài)正常，表面光滑、色澤紅潤(rùn)，質(zhì)軟邊銳，肝小葉呈福射狀排列，無(wú)炎癥壞死和纖維化形成。對(duì)照組（B)形態(tài)不規(guī)則，質(zhì)硬邊頓，表面顆粒狀，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生顯;可見(jiàn)假小葉結(jié)構(gòu)。模規(guī)組（C)形態(tài)不規(guī)則，顏色暗黑，表面見(jiàn)點(diǎn)片狀出血和壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)全小nt壞死、橋接壞死、融合性壞死及廣泛氣球樣變。

圖1.2小腸、肺及賢}D織學(xué)HE染色結(jié)果(X400).A：正常}D；B：對(duì)照組)；C：模明}D。1:腸道；2:肺；3： n。正常組(A)勾對(duì)照組(B)人鼠的肺、小腸及賢組織結(jié)構(gòu)正常。模艱組人鼠的小腸粘膜組織壞死嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)紊亂，腸絨毛脫落，乳糜管堵塞（C1)。肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁變薄，組織充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（C2)。|；^單位破壞，‘！^小球充血，焚：內(nèi)充填壞死物質(zhì)，賢小管上皮細(xì)胞壞死，，賢小管堵塞（C3)。10000.00-1 A 5000 00-1 g 150.00-1 c ?8ooo.ooj ? 4oao.ooj 二 M3 6000 ooj _ i isoooooj . X I 1_j * I1] WOO.OflJ . ■■ j;20O0.0oJ ■ I ^ J 1 ■<:1, a\\ '::Liiil‘ iUipiiIN C M6h M12hM24hM48h N C M6h M12hM24hM48h N C M6h M12hM24hM48h400.00-. 500,00-|2 300.00 ^ i 3.中 -i— F i
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R575.3

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本文編號(hào)：2594894