【摘要】：[研究背景] 乙型病毒性肝炎,簡稱乙肝,是一種由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的世界范圍傳播的疾病。乙型肝炎主要通過與被感染的人的血液和其它體液的接觸傳染。HBV感染是引起慢性肝病、肝硬化、肝細(xì)胞肝癌的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全世界有20億人感染過HBV,其中3.6億以上為慢性感染,每年大約有60萬人死于HBV感染的相關(guān)性肝病及肝細(xì)胞肝癌。注射對抗HBV感染的疫苗是目前有效預(yù)防HBV的最佳手段,但是仍然不能阻止HBV的傳播。HBV自然感染的宿主范圍狹窄,只局限于人類和大猩猩,因此目前HBV的研究缺少合適的動物模型,HBV的研究更多的依賴于細(xì)胞模型。HBV DNA轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系是體外研究HBV的結(jié)構(gòu)與功能、基因表達(dá)與調(diào)控,以及藥物篩選及耐藥機(jī)制的有力工具,然而病毒進(jìn)入肝癌細(xì)胞系的方式不是正常的感染而是轉(zhuǎn)染或者整合,因此肝癌細(xì)胞系不能用于研究早期病毒-靶細(xì)胞的相互作用(例如病毒的吸附,穿入、脫衣殼等)。原代人肝細(xì)胞對HBV有著天然的易感性,但是來源有限(新鮮的肝臟組織),體外培養(yǎng)困難(不能傳代、肝細(xì)胞特殊形態(tài)不能維持)等缺點(diǎn)限制了其做為細(xì)胞模型的可能。最近幾年,與肝細(xì)胞相關(guān)的干細(xì)胞因?yàn)槠鋸?qiáng)大的增殖能力和固有的生物學(xué)特性引起了人們的重視,肝細(xì)胞起源于骨髓細(xì)胞,骨髓細(xì)胞被視為肝細(xì)胞再生的重要源泉。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在特殊的誘導(dǎo)條件下體外能夠誘導(dǎo)成具有肝功能的成熟的類肝細(xì)胞,動物模型顯示移植入體內(nèi)的誘導(dǎo)前或者誘導(dǎo)后的BMSCs均能恢復(fù)受損的肝細(xì)胞。但是人BMSCs是否對HBV易感,是否能成為研究HBV的細(xì)胞模型目前尚未有報道。本研究用HBV體外自然感染人BMSCs,探討人BMSCs做為細(xì)胞模型研究HBV最初生命過程、HBV生物學(xué)特性、HBV與宿主細(xì)胞相互作用的早期機(jī)制及HBV耐藥機(jī)制的可能性。 本研究分為2個部分： 第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化 [目的] 探討從人骨髓中分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增BMSCs的方法,建立穩(wěn)定的人BMSCs,為后續(xù)HBV研究提供可靠的細(xì)胞模型。 [方法] 1.密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法及酶消化控制法分離、培養(yǎng)、純化人BMSCs。 2.觀察人BMSCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn),繪制人BMSCs(P5)的生長曲線,計算細(xì)胞對數(shù)生長期倍增時間。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測人BMSCs(P5)的群體DNA含量分布(細(xì)胞周期),常見的表面標(biāo)志物。 4.評估人BMSCs的傳代、凍存和復(fù)蘇的能力。 [結(jié)果] 1.成功分離培養(yǎng)了人BMSCs。細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)均一,以梭形為主,邊界清晰,胞核飽滿居中,多成橢圓形,細(xì)胞排列具有一定方向性,密度高時成漩渦狀或放射狀排列。 2.人BMSCs生長增殖旺盛,體外能長期培養(yǎng)擴(kuò)增,生長曲線呈典型的“S”型,細(xì)胞對數(shù)生長期倍增時間為31h。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。 3.流式細(xì)胞術(shù)示人BMSCs細(xì)胞周期大部分處于靜止期,小部分處于分裂周期,具有強(qiáng)大的增殖潛力；人BMSCs穩(wěn)定高表達(dá)CD90、CD105,不表達(dá)CD34、 CD45。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。 4.人BMSCs可凍存,復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性穩(wěn)定,細(xì)胞生長增殖旺盛。符合細(xì)胞模型的特點(diǎn)。 [結(jié)論] 體外培養(yǎng)的人BMSCs生長穩(wěn)定,增殖旺盛,能連續(xù)傳代,可用于進(jìn)一步的組織工程、細(xì)胞模型和分子生物學(xué)研究。 第二部分乙肝病毒體外自然感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 [目的] 評估HBV體外自然感染人BMSCs后的復(fù)制、合成、表達(dá)能力,探討人BMSCs做為細(xì)胞模型用于研究HBV的可能性。 [方法] 1. HBV DNA陽性(5.4×108copies/mL)的患者血清孵育培養(yǎng)的人BMSCs,感染細(xì)胞。 2.熒光定量PCR方法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否合成、分泌HBV DNA。 3.DNA印跡法(Southern blotting)檢測HBV是否在感染后的人BMSCs內(nèi)有效復(fù)制,形成復(fù)制中間體：共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。 4.電化學(xué)發(fā)光法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否表達(dá)、分泌乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)。 5.間接免疫熒光方法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否合成、表達(dá)乙肝病毒核心抗原(HBcAg)。 6.阻斷實(shí)驗(yàn)：將含10%的感染血清的雙無培養(yǎng)基加入不同稀釋度的抗HBsAg的特異性抗體按前述感染方法孵育人BMSCs檢測病毒進(jìn)入細(xì)胞的途徑。 [結(jié)果] 1.HBV成功自然感染人BMSCs,感染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)穩(wěn)定,生長增殖旺盛。 2.HBV陽性血清孵育后的第2天人BMSCs可以檢測到HBV DNA,第6-12天維持在相對高的水平,HBV DNA最高值為9.37×105copies/mL; HBV陽性血清孵育后的第3-15天BMSCs培養(yǎng)上清中可以檢測到HBV DNA, HBV DNA的含量分布在3.792×102copies/mL和4.067×105copies/mL之間。 3. Southern blotting檢測顯示人BMSCs在HBV陽性血清孵育后第2天就可檢測到HBV cccDNA的微弱信號(2.0kb),陽性信號隨著培養(yǎng)進(jìn)程的推進(jìn)而增強(qiáng)。 4.HBV陽性血清孵育后的人BMSCs能夠持續(xù)分泌HBsAg和HBeAg到培養(yǎng)上清中。感染后第2-16天培養(yǎng)上清中能檢測到HBsAg,最低值是1.612IU/mL,最高值是118.100IU/mL;感染后第5-13天培養(yǎng)上清中能檢測到HBeAg呈陽性表達(dá)；HBeAg檢測最低值是0.115s/co (absorbance rate/cut-off ratio),最高值是3.407s/co (≥1s/co為陽性)。 5.HBV陽性血清孵育后的第2天開始人BMSCs可以檢測到HBcAg。間接免疫熒光染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)強(qiáng)烈的彌漫性著色,細(xì)胞核部分著色,大約7%的細(xì)胞核呈陽性表達(dá),且數(shù)目隨著培養(yǎng)進(jìn)程的推進(jìn)而增多,第9天達(dá)高峰,大約20%的細(xì)胞核呈陽性表達(dá)。 6.抗HBsAg的抗體能夠阻斷HBV進(jìn)入人BMSCs,阻斷率與抗HBsAg的抗體的濃度有明顯的量效關(guān)系。 [結(jié)論] 人BMSCs對HBV自然感染易感,能在病毒侵入后啟動有效的病毒復(fù)制,形成復(fù)制中間產(chǎn)物HBV-cccDNA,表達(dá)HBV特異性抗原并合成子代病毒顆粒分泌出細(xì)胞。人BMSCs可以作為細(xì)胞模型用于研究HBV自然感染,進(jìn)行HBV感染宿主細(xì)胞的早期過程(粘附、穿入、脫衣殼)及機(jī)制的研究,進(jìn)行病毒-靶細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 謝金敏;陳建鋒;高毅;姚坤厚;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為肝樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年10期

2 唐力軍,高毅,張志,李浩,單毓強(qiáng);肝細(xì)胞生長因子聯(lián)合成纖維細(xì)胞生長因子-4誘導(dǎo)人骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化[J];中華肝臟病雜志;2005年09期

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本文編號：2593032