【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一,在全世界范圍內(nèi)感染HCV的數(shù)據(jù)是1.7億。70 80%的丙肝病毒感染是持久感染并且這其中30%的持久感染患者最終將發(fā)展成為慢性肝臟疾病,包括肝硬化,肝細(xì)胞癌等。全世界每年約有250,000～350,000人死于HCV相關(guān)終末期肝病、肝硬化及肝癌,對(duì)患者的健康和生命危害極大,早已成為嚴(yán)重的社會(huì)與公共衛(wèi)生方面的問題,但目前我們針對(duì)HCV感染的治療手段十分有限,目前主要的治療手段是干擾素加利巴韋林,但是效果不佳,而且不能用于肝硬化失代償期的患者。更令人遺憾的是,迄今為止,還沒有任何一個(gè)國家研究出可預(yù)防HCV感染的疫苗[1-3]。所以,進(jìn)一步深入揭示HCV的發(fā)病機(jī)制,探尋HCV致病的分子生物學(xué)機(jī)制也便成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題之一。 丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein 6)是本課題組前期實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選得到的一種可以與丙型肝炎病毒核心蛋白相結(jié)合的蛋白[4]。前期研究發(fā)現(xiàn),HCBP6蛋白能夠上調(diào)和下調(diào)一系列不同基因的表達(dá)水平,這些差異表達(dá)的基因與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、增生、分化及生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)。因此,對(duì)HCBP6進(jìn)行更深一步的研究是十分必要的。 前期,我們從轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)入手對(duì)HCBP6進(jìn)行了研究,應(yīng)用相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)HCBP6基因啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測,并通過缺失等方法進(jìn)一步驗(yàn)證該啟動(dòng)子活性區(qū)域的存在,還用EMSA(凝膠遷移率實(shí)驗(yàn))對(duì)該活性區(qū)域以及與該區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行驗(yàn)證�，F(xiàn)在我們分別構(gòu)建HCBP6過表達(dá)和RNAi載體并且經(jīng)過篩選得到抑制效率高的RNAi載體,通過劃痕試驗(yàn)來初步證明HCBP6可能有的功能。 目的 本課題旨在研究HCBP6蛋白在肝癌細(xì)胞系HepG2增殖過程中發(fā)揮的作用,分別從構(gòu)建過表達(dá)載體和RNAi載體兩個(gè)方面來證明HCBP6蛋白在HepG2細(xì)胞中可能具有的功能,給后續(xù)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)做一個(gè)探索。 方法 1、成功構(gòu)建過表達(dá)載體,在該載體上加入c-myc和His標(biāo)簽為后續(xù)蛋白純化及篩選識(shí)別實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備 2、構(gòu)建RNAi載體,通過熒光顯微鏡來初步判定轉(zhuǎn)染效率,并且提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA做Real Time PCR來檢測并篩選出抑制效率高的兩個(gè)RNAi質(zhì)粒。 3、通過初步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來初步驗(yàn)證HCBP6對(duì)于真核肝癌細(xì)胞HepG2遷移速率的影響,判斷該基因?qū)τ诟伟┘?xì)胞HepG2遷移,即對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的影響。 結(jié)果 1.成功獲得了HCBP6的過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6。 2.成功獲得HCBP6的含有綠色熒光蛋白的RNAi載體,且測序證實(shí)插入序列與理論序列一致。試驗(yàn)組的表達(dá)活性與對(duì)照組的表達(dá)活性相比降低0.6倍。獲得了具有較高抑制效率的含有HCBP6基因序列的質(zhì)粒。 3.本實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞在經(jīng)劃痕試驗(yàn)檢測后得到:HCBP6可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在0-6h每小時(shí)遷移13微米,在6-12h每小時(shí)遷移7微米,12-24h每小時(shí)遷移13微米,而陰性熒光對(duì)照組0-6h每小時(shí)遷移12微米,6-12h每小時(shí)遷移5微米,12-24h每小時(shí)遷移13微米,由此獲得實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移速率與對(duì)照組相比有加快趨勢。從而初步證明HCBP6基因?qū)τ诟伟┘?xì)胞HepG2遷移,即對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能有影響。 結(jié)論 1.構(gòu)建pcDNA3.1/myc-his(-)-HCBP6過表達(dá)載體。 2.成功構(gòu)建HCBP6的干擾載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-HCBP6。 3.HCBP6對(duì)于肝癌細(xì)胞HepG2可能具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用,對(duì)HCBP6功能學(xué)方面研究進(jìn)行了初步探索
【圖文】：

結(jié) 果1、圖2-1 RNAi載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞拍攝的照片100× 500× 100×從圖2-1中我們可以看到細(xì)胞在紫外線的照射下所發(fā)出的綠色熒光，進(jìn)而證明我們構(gòu)建的質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。

放大倍數(shù)100×
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R512.63

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8 馬s，

本文編號(hào)：2592760