【摘要】：研究背景及目的非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指無過量飲酒史,以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。其疾病譜隨病程主要包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纖維化和肝硬化。其中,纖維化階段是肝相關疾病死亡率的最高階段。因此,早期采取有效的治療手段非常重要。2018年NAFLD防治指南(中華醫(yī)學會肝病分會脂肪肝和酒精肝肝病學組)指出:存在NASH或進展性肝纖維化需要應用護肝藥物(熊去氧膽酸等),但其治療周期長、療效仍需進一步臨床試驗證實。2017年NAFLD中西醫(yī)結合診療共識(中國中西醫(yī)結合學會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會)指出:存在肝損傷或者進展性肝纖維化者,應加用護肝和抗纖維化藥物(熊去氧膽酸、安絡化纖丸、扶正化瘀膠囊等),中西醫(yī)結合治療可以改善生活質量,提高臨床療效。近年來的基礎實驗及臨床研究發(fā)現,中醫(yī)藥在防治肝纖維化有獨特的效果。遵循配伍組方規(guī)律的驗方--抗纖軟肝方,前期研究表明,可以顯著改善慢性乙型病毒性肝炎肝纖維化及肝硬化患者的臨床癥狀與肝功能、肝纖維化指標。同時在臨床應用中,我們發(fā)現其聯合熊去氧膽酸對非酒精性脂肪肝纖維化亦有較好的療效,但其治療NAFLD肝纖維化缺乏系統(tǒng)性臨床對照研究,相關機制尚不明確。因此,本研究目的一是對比熊去氧膽酸單藥,抗纖軟肝方聯合熊去氧膽酸的療效和安全性。二是對比安絡化纖丸聯合熊去氧膽酸,抗纖軟肝方聯合熊去氧膽酸療效是否更具優(yōu)勢。三是對NAFLD肝纖維化不同中醫(yī)證型的療效。四是防治NAFLD肝肝纖維化作用機制。為臨床應用提供理論基礎。研究方法本研究分為臨床研究和動物實驗研究兩大部分。臨床研究采用回顧性研究方法,對同時符合納入標準和排除標準確診為非酒精性脂肪肝病的患者按用藥情況分為三組:A組:口服抗纖軟肝方聯合熊去氧膽酸;B組:口服安絡化纖丸聯合熊去氧膽酸;C組:單用熊去氧膽酸。分別分析三組患者治療前后肝功能、肝纖四項、Child-Pugh分級、脾臟彩超、中醫(yī)癥候積分以及A組不同中醫(yī)證型癥候積分差異。動物實驗分為兩個部分,實驗一:將56只SPF級Wistar大鼠自適應喂養(yǎng)一周后,隨機分成7組,每組8只。(1)對照組(Control,CTRL);(2)模型組(Model,MOL);(3)扶正化瘀組(Fuzheng huayu,FZHY);(4)秋水仙堿組(Colchicine,COL);(5)正常劑量抗纖軟肝方組(Normal Kangxian ruangan,N-KXRG);(6)中劑量抗纖軟肝方組(Middle Kangxian ruangan,M-KXRG)和(7)高劑量抗纖軟肝方組(High Kangxian ruangan,H-KXRG)。其中對照組大鼠正常投喂MCS對照飼料,而模型組及5個藥物預處理組的大鼠均投喂MCD飼料。在正常投喂飼料的同時,各組大鼠均進行對應藥物灌胃處理:(FZHY組:15 g/kg/d;COL組:0.1 mg/kg/d;N-KXRG組:9.2 g/kg/d;M-KXRG組:18.4 g/kg/d;H-KXRG組:36.8 g/kg/d),而對照(CTRL)組和模型(MOL)組大鼠做對照藥物處理(均行2 m L/100g/d生理鹽水灌胃)。整個過程持續(xù)8周。8周后,分別檢測各組大鼠血清中各生化指標(丙氨酸轉氨酶ALT、天冬氨酸轉氨酶AST、γ-谷酰胺轉酞酶GGT、總膽固醇CHOL以及甘油三酯TG)的水平;ELISA分別檢測大鼠血清中透明質酸(HA)、層連蛋白(LN)、IV-膠原蛋白(IV-C)、III-前膠原蛋白(PC-III)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細胞介素-10(IL-10)的分泌水平;蘇木精-伊紅(HE)染色和馬森(Masson)染色檢測各組大鼠肝組織病理學變化;TUNEL染色檢測各組大鼠肝組織中肝細胞凋亡情況;Western blotting檢測肝組織中線粒體凋亡信號通路上的相關蛋白(Caspases家族及Bcl-2家族)的表達量。實驗二:30只SPF級Wistar大鼠自適應喂養(yǎng)一周后,被隨機分為3組(每組10只):(1)對照組(Control,CTRL);(2)模型組(Model,MOL);(3)抗纖軟肝方組(Kangxian ruangan,KXRG)。其中對照組大鼠正常投喂MCS對照飼料,而模型組及KXRG藥物預處理組的大鼠均投喂MCD飼料。在正常投喂飼料的同時,各組大鼠均進行對應藥物灌胃處理(KXRG組:36.8 g/kg/d),對照(CTRL)組和模型(MOL)組大鼠做對照藥物處理(均行2 m L/100g/d生理鹽水灌胃)。整個過程持續(xù)8周。8周后,ELISA檢測各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細胞介素-6(IL-6)的分泌水平;蘇木精-伊紅(HE)染色檢測各組大鼠肝組織病理學變化;Western blotting檢測TGF-β信號通路上的相關蛋白(TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3和Smad7)以及TLR4信號通路上相關蛋白(TLR4、My D88和NF-κB)的表達量。研究結果1.臨床研究結果1.1三組患者臨床綜合療效比較:A組總有效率90%,B組總有效率80%,A組與C組、B組與C組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。A組總有效率高于B組,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.2三組患者生化指標比較:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和總膽紅素(TBil):三組治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。A組和B組治療后與C組治療后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。谷氨酰轉肽酶(GGT):三組治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。三組治療后比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.3三組患者肝纖維化指標比較:透明質酸(HA)和IV型膠原(IV-C):三組治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。三組治療后下降幅度依次為:A組B組C組,并且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。層粘連蛋白(LN):A組和B組治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。C組治療前后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。A組與B組治療后差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。A組和B組治療后與C組治療后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。1.4三組患者Child-Pugh評分比較:三組治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。A組和C組治療后比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。B組和C組治療后比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.5三組患者彩超指標比較:各組門脈內徑治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。脾臟厚度:A組和B組治療前后差異有統(tǒng)計學意義,(P0.01)。三組治療后下降幅度依次為:A組B組C組,并且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。1.6 A組各中醫(yī)證型綜合療效比較:五個中醫(yī)證型總有效率依次為:痰瘀互結證痰濕內阻證肝郁氣滯證肝郁脾虛證濕熱蘊結證,各組總有效率比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。1.7 A組各中醫(yī)證型證候積分比較:五組證候積分治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),治療后差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.實驗一生化指標檢測結果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠肝功能(ALT、AST和GGT)及血脂水平(CHOL和TG)均顯著降低(P0.01),尤其是H-KXRG組變化最顯著。ELISA檢測結果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠血清中纖維化相關蛋白均顯著降低(P0.01),促炎因子TNF-α水平顯著降低(P0.01),抑炎因子IL-10水平顯著升高(P0.01),尤其是H-KXRG組變化最為顯著。HE染色結果顯示,與MOL組比較,FZHY和COL治療組大鼠肝小葉結構受損輕,可見肝細胞炎性細胞浸潤,膠原纖維增生減輕;不同濃度的KXRG治療組大鼠肝小葉結構基本正常,肝細胞排列尚整齊,中央靜脈周圍可見部分肝細胞變性,病變區(qū)域面積較小,且肝細胞變性程度輕,纖維組織異常增生不明顯,其中尤以H-KXRG治療組大鼠肝組織病理變化緩解最顯著。Masson染色結果顯示,與MOL組比較,各治療組大鼠肝臟中膠原纖維組織增生呈不同程度的減少,纖維化程度有明顯好轉,部分較細的藍色纖維走行于血管周圍,其中尤以H-KXRG治療組大鼠肝組織纖維增生緩解最顯著。TUNEL染色結果顯示,與MOL組比較,在各治療組中大鼠肝臟中棕褐色的凋亡細胞顯著減少,凋亡率呈現不同程度的下降(P0.01);尤其是H-KXRG組肝細胞凋亡率降低的最為顯著。Western blotting檢測結果顯示,與MOL組相比,Caspase-3、8、9的蛋白水平在各治療組中均有不同程度的下降(P0.01)。其中在H-KXRG組中,Caspase-3、8、9的蛋白表達量下降幅度最大。促凋亡蛋白-Bax的表達水平變化趨勢與Caspase家族(Caspase 3、8、9)相似,但抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL)和Bax的變化趨勢則呈現相反的方向。3.實驗二ELISA檢測結果顯示,與MOL組比較,KXRG治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低(P0.01)。HE染色結果顯示,與MOL組比較,KXRG治療組大鼠肝小葉結構基本正常,肝細胞排列尚整齊,中央靜脈周圍可見部分肝細胞變性,病變區(qū)域面積較小,且肝細胞變性程度輕,纖維組織異常增生不明顯。Western blotting結果顯示,一方面,TGF-β信號通路相關蛋白中,與MOL組比較,KXRG治療組TGF-β1、TGF-β2、Smad2和Smad3的表達水平顯著降低(P0.01),而Smad7蛋白表達水平顯著升高(P0.01);另一方面,TLR4信號通路相關蛋白中,與MOL組比較,KXRG治療組中TLR4、My D88和NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P0.01)。研究結論1.抗纖軟肝方聯合熊去氧膽酸治療非酒精性脂肪肝肝纖維化比熊去氧膽酸單藥療效好,可以改善肝功能、脾臟腫大狀況、降低Child-Pugh評分,降低中醫(yī)證候積分、抗纖維化作用強,安全性高。2.對比安絡化纖丸聯合熊去氧膽酸,在抗纖維化作用、改善Child-Pugh評分和繼發(fā)性脾臟腫大方面更具優(yōu)勢。3.在不同中醫(yī)證型中,痰瘀互結證療效最佳。4.抗纖軟肝方能顯著改善NAFLD肝纖維大鼠的肝功能、血脂水平、肝臟病理學變化、肝細胞凋亡情況,且作用效果比對照藥物(扶正化瘀及秋水仙堿)更加顯著。5.抗纖軟肝方能顯著改善NAFLD肝纖維大鼠血清中TNF-α、IL-6分泌水平。6.抗纖軟肝方可能是通過調控Caspases家族及Bcl-2家族相關蛋白的表達發(fā)揮對NAFLD肝纖維化大鼠肝臟中肝細胞凋亡的抑制作用。7.抗纖軟肝方可能是通過調控TGF-β信號通路及TLR4信號通路防治NAFLD大鼠肝纖維化。創(chuàng)新性及科學意義首次通過臨床研究和實驗相結合的方法,初步明確抗纖軟肝方治療NAFLD肝纖維化療效以及其作用機制。為臨床應用提供理論基礎。
【圖文】：

圖 1 動物造模及藥物處理示意圖注：Control group:對照組（以 2 mL/100g/d 生理鹽水灌胃）；Model group:模型組mL/100g/d 生理鹽水灌胃）；FZHY group:扶正化瘀組（以 15 g/kg/d 扶正化瘀膠囊提胃）；Colchicine group:秋水仙堿組（以 0.1 mg/kg/d 秋水仙堿提取物灌胃）；KXRG 抗纖軟肝方組；N-KXRG group:正常劑量抗纖軟肝方組（以 9.2 g/kg/d 抗纖軟肝提取物M-KXRG group:中劑量抗纖軟肝方組（以 18.4 g/kg/d 抗纖軟肝提取物灌胃）；H-KXRG 高劑量抗纖軟肝方組（以 36.8g/kg/d 抗纖軟肝提取物灌胃）。2.2 大鼠血清生化指標檢測8 周后，禁食 12 h 的各組大鼠均行 60mg/kg 的戊巴比妥溶腔注射麻醉，從大鼠的腹主動脈采集血液樣本，室溫自然凝固 304℃，1000r/min，離心 15min，分離血清，收集上清，將上清液

圖 2 各組大鼠血清生化指標檢測注：A：ALT 水平變化；B：AST 水平變化；C：GGT 水平變化；D：CHOL 水平變化；E：TG 水平變化。CTRL：對照組；MOL：模型組；FZHY：扶正化瘀治療組；COL 秋水仙堿治療組；N-KXRG：正常劑量抗纖軟肝方治療組；M-KXRG：中劑量抗纖軟肝方治療組；H-KXRG：高劑量抗纖軟肝方治療組。數據采用均值±標準差（X±SD）的形式表示（n=8）。與 CTRL 組比較，bP＜0.01；與 MOL 比較，dP＜0.01；與 FZHY 組比較，fP＜0.01；與 COL 組比較，hP＜0.01；與 N-KXRG組比較，jP＜0.01；與 M-KXRG 組比較，lP＜0.01。3.2 各組大鼠血清 ELISA 檢測通過血清 ELISA 檢測，評估肝纖維化及炎癥反應的水平。ELISA檢測結果顯示，，一方面，如圖 3A-2D 所示，與 CTRL 組比較，MOL 組
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2592563