【摘要】：酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)作為潛在發(fā)展的病理機(jī)制,是長期大量飲酒所致的肝臟疾病,近年來,死亡率有增高趨勢。酒精是酒精性脂肪肝的高危因素,因?yàn)橐掖嫉拇x產(chǎn)物直接或間接影響氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化,使脂肪肝病情加重,或可演變?yōu)楦斡不踔粮伟�。白藜蘆醇(Resveratrol, RES)是一種主要來源于花生、葡萄的酚類化合物,具有很強(qiáng)的抗氧化作用,也是一種安全、有效的保肝藥物。前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用,但其對酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性的作用機(jī)理尚不完全清楚。自噬(autophagy)是一種常見的細(xì)胞內(nèi)“自食”現(xiàn)象,自噬的形成可概括如下：首先細(xì)胞膜包裹細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器等形成自噬體,自噬體與溶酶體融合后,自噬體的包含物被降解,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)的一種大分子物質(zhì)降解機(jī)制,其依賴溶酶體降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),是維持能量平衡必不可少的條件。自噬是一種動(dòng)態(tài)過程,在基礎(chǔ)狀態(tài)也可發(fā)生自噬(基礎(chǔ)自噬),因此自噬在維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡,應(yīng)對外界環(huán)境變化,清除受損的蛋白質(zhì)等方面扮演重要角色。研究表明,自噬在不同的酒精性肝病中發(fā)揮著不同的作用,通過調(diào)節(jié)自噬預(yù)防和治療肝臟疾病有望成為一種新的靶向策略,也成為近年研究的熱點(diǎn)之一。目的：本研究旨在通過自噬途徑研究白藜蘆醇對酒精性脂肪肝的保護(hù)作用機(jī)制,并進(jìn)一步探討SREBP-1c/ACC在此機(jī)制中的作用。方法：采用Lieber-DeCarli酒精液體飲食加一次急性酒精灌胃的方法,建立小鼠酒精性脂肪肝模型。RES灌胃給藥,造模周期16天,于第16天灌胃酒精,9小時(shí)后處死小鼠,測定肝臟及血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,組織HE染色觀察小鼠肝臟病理學(xué)變化,透射電鏡檢測自噬體情況,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62的表達(dá),以及SREBP-lc/ACC蛋白的表達(dá)。同時(shí)采用酒精聯(lián)合油酸共同刺激HepG2細(xì)胞建立體外肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型,MTT檢測細(xì)胞活性,油紅O染色對體外模型進(jìn)行評價(jià),試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)TG水平,吖啶橙染色評估自噬溶酶體變化,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和p62的表達(dá),以及SREBP-lc/ACC蛋白在加入AMPK抑制劑Compound C后的表達(dá)變化。結(jié)果：1 病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組可見明顯的脂肪空泡,表明小鼠酒精性脂肪肝模型建立成功,RES給藥后可顯著改善肝臟的脂肪變性程度。生物學(xué)指標(biāo)檢測表明,RES可顯著降低血清ALT、AST、LDL-C和TG水平,升高血清HLD-C的水平。以上結(jié)果提示,RES對AFL小鼠有明顯的保護(hù)作用。2 與AFL小鼠模型組比較,RES給藥組可見明顯自噬體形成,RES給藥可增加自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá),降低p62的表達(dá)。結(jié)果提示白藜蘆醇對小鼠酒精性脂肪肝的防治作用,可能與其誘導(dǎo)自噬有關(guān)。與正常對照組比較,模型組SREBP-1c表達(dá)顯著增加,ACC的磷酸化水平顯著降低；RES用藥后顯著增加ACC的磷酸化水平,降低了SREBP-1c的表達(dá),結(jié)果提示,白藜蘆醇能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減輕脂質(zhì)沉積,保護(hù)小鼠酒精性脂肪肝。3 乙醇和油酸刺激的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累模型中,油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TG檢測證明體外脂質(zhì)積累細(xì)胞模型成功。與對照組比較,模型組細(xì)胞中紅色脂滴明顯增加,RES用藥后細(xì)胞中脂滴顯著降低。細(xì)胞內(nèi)TG水平檢測結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組細(xì)胞內(nèi)TG的含量明顯升高,RES用藥后顯著降低了細(xì)胞內(nèi)TG的水平。這些結(jié)果表明RES能改善乙醇和油酸刺激的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累。4 與乙醇和油酸刺激的HepG2細(xì)胞模型組比較,吖啶橙染色結(jié)果顯示RES誘導(dǎo)自噬溶酶體的形成,增加自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá),降低p62的表達(dá),而自噬抑制劑3-MA抑制了RES這一效應(yīng),表明RES可能通過誘導(dǎo)自噬緩解HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累。與對照組比較,模型組ACC的磷酸化水平顯著降低,SREBP-1c表達(dá)顯著增加：RES用藥后顯著增加ACC的磷酸化水平,降低了SREBP-1c的表達(dá),而AMPK抑制劑Compound C逆轉(zhuǎn)了RES的這一效應(yīng),同時(shí)Compound C抑制自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)。這表明RES誘導(dǎo)自噬緩解HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累可能與激活SREBP-1c/ACC信號通路有關(guān)。結(jié)論：白藜蘆醇可通過誘導(dǎo)自噬發(fā)揮對酒精性脂肪肝的保護(hù)作用,并且與激活SREBP-1c/ACC有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5

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本文編號：2570666