【摘要】：炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD),是一種遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素共同參與的腸道非特異性炎性疾病。其中,UC是一種主要累及腸道黏膜層,以彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c的慢性腸炎。其發(fā)病機制目前尚不清楚,治療進展緩慢且缺乏特異性,發(fā)病率在我國有逐年上升的趨勢。我國潰瘍性結(jié)腸炎的患病率為11.6/10萬,并且已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要原因,且患者多為青壯年,因此日益受到重視。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)是一種硫酸多糖體,能誘發(fā)UC。其機制可能與免疫細胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)有關。目前已有研究表明,IBD不僅與遺傳因素有關,還與DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控有關,這些均可以調(diào)節(jié)炎癥相關的基因的功能。多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis, MS),是一種中樞神經(jīng)脫髓鞘自身免疫病。多發(fā)生在青年人群中的。在我國發(fā)病率為萬分之五。多發(fā)性硬化病人的臨床表現(xiàn)癥狀主要有視神經(jīng)受損導致的視力下降,肢體行動不協(xié)調(diào),大小便失禁等。由于其癥狀較為嚴重而且容易復發(fā)所以日益受到廣泛的關注。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是模仿人類MS的經(jīng)典動物模型。有研究表明CD4+CD25+Treg細胞在EAE小鼠神經(jīng)中樞高表達,并且通過局部免疫抑制調(diào)控EAE的發(fā)展。Mo他叫MYST1,是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,它能將組蛋白H4的第16位賴氨酸(H4K16)乙�；�,Mof也可以乙酰化非組蛋白p53、TIP5等,乙�；梢约せ罨蜣D(zhuǎn)錄。Mof在正常的細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生過程中起著不可替代的重要作用。研究表明Foxp3可以協(xié)助Mof完成激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。腫瘤壞死因子TGF-β在Mof的作用下刺激Foxp3基因的活化,表達Foxp3。因此,研究Mof對Treg細胞的調(diào)控作用可以使我們更深入的了解自身免疫疾病的發(fā)病機制。研究目的：通過動物模型即利用C57BL/6小鼠分別飲用3.5%的DSS溶液建立急性UC模型和體內(nèi)注射MOG35-55多肽抗原建立EAE模型。通過形態(tài)學,組織病理學,分子生物學,細胞化學等試驗檢測方法,觀察UC發(fā)病小鼠腸黏膜組織與對照組相比發(fā)生的各種變化。對比EAE發(fā)病不同時期與正常組的區(qū)別。進而探討組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof在自身免疫病發(fā)病機制中的有關作用,為人類自身免疫疾病的預防與臨床治療提供理論依據(jù)。研究方法：選取同一窩出生的且體重相近的6.8周的雌性C57BL/6小鼠作為材料,隨機且平均分成兩組,每組至少3只進行以下實驗：1.選取其中兩組小鼠分別用于建立急性UC模型和EAE模型。2.其中UC實驗組分為DSS誘導3天和7天兩小組,收集相同部位的結(jié)腸組織,用于后續(xù)實驗；EAE實驗組分為發(fā)病初期、高峰期和緩解期三個時期,收集脾臟組織。3.觀察正常組與UC實驗組小鼠結(jié)腸的區(qū)別和EAE實驗組小鼠與對照組運動能力的區(qū)別,確定模型構(gòu)建成功。4.細胞化學染色觀察DSS誘導3天和7天的組織病理學變化及嚴重程度。5.結(jié)腸組織切片進行免疫熒光雙染,觀察組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof和Tregs關鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達情況,并進行組織、細胞中的定位。6.UC實驗組與對照組和EAE實驗組與對照組的組織分別用TRIzol裂解細胞提取細胞總RNA, qPCR擴增,定量分析炎癥有關基因與免疫因子的相對表達量。7.從兩個實驗組和對照組小鼠組織中提取總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳分析Mof,Foxp3蛋白的表達變化情況。8. Co-Immunoprecipitation (Co-IP)驗證Mof與Foxp3有無物理上的相互作用。9.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP-qPCR)實驗分析小鼠組織中Mof在特定基因啟動子區(qū)域的結(jié)合狀況,從而探討自身免疫病及炎癥的發(fā)病機制。10.結(jié)直腸癌細胞HCT116細胞中過表達Mof,確定Mof對相關基因的調(diào)控作用。實驗結(jié)果：1.形態(tài)學觀察：分離C57BL/6小鼠的結(jié)腸組織,觀察UC實驗組與對照組相比,結(jié)腸長度明顯縮短,并且結(jié)腸有出血現(xiàn)象,且7天的組織變化更明顯,結(jié)腸內(nèi)部明顯的觀察到血便；EAE實驗組小鼠行走緩慢,尾部無力,甚至出現(xiàn)雙后肢癱瘓。2.組織的病理切片：用蘇木精伊紅染色的方法鑒定,DSS飲用組小鼠的結(jié)腸粘膜層發(fā)生細胞凋亡,并伴有嚴重的黏膜脫落現(xiàn)象。3.免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof表達于結(jié)腸組織固有層細胞的細胞核中,并且與Foxp3蛋白共定位。4.Mof, Foxp3,Il17, Tlr3, Tlr4, Tlr5, Tlr6, Tlr7, Tlr9 mRNA活性水平的變化,以18srRNA為參照,定量分析。DSS飲用7天的小鼠結(jié)腸組織其Mof, Foxp3,1117的mRNA表達明顯高于對照組,Tlr4, Tlr6, Tlr9 mRNA表達水平也顯著高于對照組。DSS飲用3天的小鼠結(jié)腸組織中,Mof, Foxp3, Il17的]mRNA表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異。EAE實驗組Mof, Foxp3,Il17的mRNA表達明顯高于對照組,且與發(fā)病程度呈正相關。Tlr4, Tlr5, Tlr7, Tlr9 mRNA表達水平也高于對照組。5. SDS-PAGE;凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)無論是UC實驗組還是EAE實驗組組織中Mof,Foxp3蛋白表達量均高于對照組。6.Co-IP實驗表明Mof與Foxp3在體內(nèi)存在相互作用。7. ChIP-qPCR結(jié)果表明Mof可以結(jié)合到Foxp3, Tlr3, Tlr4, Tlr5, Tlr6, RoRrt基因啟動子區(qū)。8.Mof過表達的HCT116細胞中,Tlr4蛋白和Foxp3蛋白表達量與對照組對比均明顯增加。qRT-PCR結(jié)果同樣證明了相似的結(jié)果。結(jié)論：1、本研究運用68周的C57BL/6小鼠作為材料,分別應用DSS葡聚糖硫酸鈉(5000D)和MOG35-55多肽誘導結(jié)腸炎癥和多發(fā)性硬化的發(fā)生,是一種建立潰瘍性結(jié)腸炎模型和實驗性變態(tài)性腦脊髓炎模型的簡便可靠的方法。這兩種模型可以用來研究人類炎性腸病的致炎機制及多發(fā)性硬化的發(fā)病機制。2、本研究發(fā)現(xiàn),除遺傳因素外,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mo嶼潰瘍性結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化癥的發(fā)病有一定的關系,Mof通過與Foxp3相互作用從而調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。3、Th17細胞分泌的炎性細胞因子1117可以促進多發(fā)性硬化的發(fā)展,但是在UC小鼠模型中卻起到了雙重作用。4、此外,研究還發(fā)現(xiàn)Tlr4及RoRrt也許在結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化等自身免疫疾病發(fā)病機制中起到一定的作用,Mof可能參與調(diào)控這些基因的表達。
【圖文】：

Ｅ小樐結(jié)腸和脾臟紐織中ｍ民ＮＡ變化的檢測逡逑ＥＡＥ小鼠中Ｍｏｆ，Ｆｏｘｐ３基因表達情況，與對照組相比有明顯差異。逡逑ＮＡ表達水平均ｔｉＵＳｓｒＲＮＡ作為參照。在ＤＳＳ誘導３天的結(jié)腸組織中，Ｍｏｆ、逡逑達與野生型小鼠結(jié)腸姐織相比無明顯差異。ＤＳＳ誘導７天后，Ｍｏｆ，Ｆｏｘｐ３逡逑高于對照納。逡逑測巳ＡＥ小鼠中Ｔｌｒｓ基因表達情況顯示，Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ邋４、Ｔｌｒ邋５、Ｔｌｒ邋７、Ｔｌｒ邋９邋ｍＲＮＡ逡逑量增加，其中Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ７、Ｔｌｒ９變化最為顯著。逡逑ＤＳＳ小鼠中Ｔｌｒｓ基因表達情況，結(jié)果最示在Ｄ巧誘導７天的結(jié)腸組織中，逡逑９的變化與對照組有統(tǒng)計學差異。然而在ＤＳＳ誘導３天的結(jié)腸組織中與對照逡逑；＊＊b6＜０．０１邋ＶＳ對照組；＊＊＊尸＜０．００１邋ＶＳ對照組；ｎｓ無統(tǒng)計學差異。逡逑ｆ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＤＳＳ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｉｃｅ邋ａｎｄ邋ＥＡＥ邋ｍｉｃｅ逡逑ｎ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｍｏｆ邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉｎ邋ＥＡＥ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ逡逑ｃｏｎ化ｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑ｌｓ邋ｗｅｉ＊ｅ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋ｔｏ邋化ｏｓｅ邋ｏｆ邋１８ｓｒＲＮＡ．Ｄｕｒｉｎｇ邋化ｅ邋ＤＳＳ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋３邋ｄａｙｓ，化ｅ逡逑ａｎｄ邋１Ｌ１７邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｍｉｌａｒ邋ｗｉｔｈ邋ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ａｎｄ邋ｍｉｃｅ．邋Ａｆｔｅｒ邋ＤＳＳ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋７邋ｄａｙｓ，邋ｔｈｅ逡逑１７邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗｅｒｅ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ邋４、Ｔｌｒ邋５、Ｔｌｒ邋７邋ａｎｄ邋Ｔｌｒ邋９邋ｉ

（Ｂ）逡逑Ｔ１］６細胞過表達Ｍｏ垢檢測各基因的蛋白表達與基因轉(zhuǎn)錄變化情況。逡逑ｌｒ４及Ｆｏｘｐ３蛋白在Ｍｏｆ過表達的ＨＣＴ１１６細胞情況進巧檢測，發(fā)現(xiàn)Ｔｌｒ４及Ｆｏｘｐ３表達量逡逑加。逡逑ｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ９、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ１７基因在Ｍｏｆ過表達的ＨＣＴ１１６細胞情況進行檢測，１８ｓｒＲＮＡ逡逑，，發(fā)現(xiàn)Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ１７基因ｍＲＮＡ水平顯著增加。逡逑．Ｏｌｖｓ對照組；＊＊＊尸＜０．００１邋ＶＳ對照組；ｎｓ無統(tǒng)計學差異。逡逑ｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｖｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓ邋Ｍｏｆ邋ｉｎ邋ＨＣＴＨ邋６邋ｃｅｌｌｓ．逡逑ｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｔｌｒ４邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉ打化ｅ邋ＨＣＴｌ邋１６邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｈａｔ邋ｏｖｅｒ逡逑ｅｄ邋Ｍｏｆ．邋Ｗｅ邋ｆｏｕｎｄ邋ｔｈａｔ邋ＴＩｒ４邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｔｈａｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑ｍ民ＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋化化ｏｓｅ邋ｏｆ邋１８ｓｒＲＮＡ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｏｖｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓ邋Ｍｏｆ邋ｉｎ邋ＨＣＴｌ邋１６逡逑ｅ邋Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｆｏｘｐ３邋ａｎｄ邋ＩＬ１７邋ｍＲＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｈｈ邋化ｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑．０１邋ｖｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１邋ｖｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋ｎｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｎｏ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ逡逑ｃｅｓ．逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574

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本文編號：2530173