【摘要】：背景:近年研究表明,表達于肝星狀細胞(HSCs)、肝細胞(HCs)及枯否細胞(KCs)表面的NADPH氧化酶(NOX)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本課題組前期體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)熊果酸(UA)具有抗肝纖維化作用;體外研究發(fā)現(xiàn)UA能阻斷HSCs表面的NOX誘導(dǎo)其凋亡;抑制HCs表面的NOX保護HCs。但UA體內(nèi)對HSCs、HCs及KCs中NOX表達的影響尚不明確。本課題以纖維化大鼠作為研究對象,以加拿大麻素(AP)作為陽性對照,正常大鼠作為空白對照,觀察UA干預(yù)(預(yù)防和治療)對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)作用;明確UA體內(nèi)抗肝纖維化的機制是否與抑制HSCs、HCs及KCs中NOX的表達相關(guān)。目的:觀察UA干預(yù)后肝纖維化大鼠體內(nèi)肝星狀細胞、肝細胞及枯否細胞表面NOX的表達,探討UA體內(nèi)抗纖維化的機制及分子靶點。方法:1.將雄性SD大鼠隨機分為6組:空白對照組、肝纖維化模型組、AP預(yù)防及治療組、UA預(yù)防及治療組,其中,肝纖維化組給予四氯化碳(CCl4)灌胃2ml/kg(橄欖油稀釋20%濃度)每周兩次,共8周;預(yù)防組在CCl4灌胃2周后,給予AP或UA(40mg/kg/d)灌胃6周,同時繼續(xù)CCl4灌胃6周;治療組在CCl4灌胃8周后,再給予AP或UA(40mg/kg/d)灌胃4周。藥物處理結(jié)束72h后,獲取血、肝臟標本。2.HE染色觀察肝小葉結(jié)構(gòu);天狼星紅染色法觀察膠原沉積程度;比色法測定血清及肝臟組織羥脯氨酸含量;WB檢測肝組織的I型膠原、TGFβ1、MMP-1、TIMP-1和α-SMA的蛋白含量。3.全自動生化儀檢測大鼠血清中ALT、ALB、TBIL;IHC檢測大鼠肝組織PCNA表達;TUNEL檢測肝細胞凋亡。4.WB檢測肝組織中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表達。5.原位灌注+梯度離心分離原代HSCs、HCs及KCs,RT-qPCR檢測三種細胞NOX的mRNA水平。結(jié)果:1.熊果酸體內(nèi)干預(yù)對肝纖維化的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防和治療組肝臟組織纖維間隔及膠原沉積均減輕,大鼠血清及肝臟組織羥脯氨酸含量顯著降低(P0.001);UA預(yù)防組肝臟組織中I型膠原、TGFβ1、TIMP-1及α-SMA蛋白表達水平均降低(分別為P0.01,P0.001,P0.01及P0.001);UA治療組上述指標也降低(分別為P0.001,P0.001,P0.01及P0.001);UA預(yù)防和治療組肝臟組織MMP-1蛋白表達水平升高(P0.01)。2.熊果酸體內(nèi)干預(yù)對肝功能及肝細胞的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防和治療組大鼠血清ALT、TBIL水平下降,而ALB水平上升(均為P0.001);肝細胞增殖增加(P0.01),凋亡減少(P0.01)。3.熊果酸體內(nèi)干預(yù)對肝臟組織中NOX蛋白的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防組肝臟組織中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表達均減少(分別為P0.01,P0.01和P0.001);UA治療組上述指標蛋白表達也減少(分別為P0.001,P0.01和P0.001)。4.熊果酸體內(nèi)干預(yù)對HSCs、HCs及KCs中NOX mRNA的影響4.1熊果酸體內(nèi)干預(yù)對HSCs中NOX mRNA的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防組HSCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下調(diào)(分別為P0.01,P0.01和P0.001);UA治療組上述指標的mRNA水平也下調(diào)(分別為P0.001,P0.01和P0.001)。4.2熊果酸體內(nèi)干預(yù)對HCs中NOX mRNA的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防組HCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降(分別為P0.001,P0.01和P0.001);UA治療組HCs中NOX2及NOX4的mRNA水平也下降(分別為P0.01和P0.001),而UA治療組HCs中NOX1的mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.3熊果酸體內(nèi)干預(yù)對KCs中NOX mRNA的影響與纖維化組相比,UA預(yù)防組KCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降(均為P0.001);UA治療組KCs中上述指標的mRNA水平也下降(分別為P0.01,P0.05和P0.001)。結(jié)論:熊果酸體內(nèi)抗肝纖維化機制與其下調(diào)肝星狀細胞、肝細胞及枯否細胞NOX的表達有關(guān)。
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圖片說明： 第 2 章 材料與方法2×Super Real PreMix Plus 10μl5×ROX Reference Dye 2μl正向引物 0.5μl反向引物 0.5μlRNase-Free ddH2O 5μlC-DNA 2μl漩渦振蕩混勻，短時離心后，置于熒光定量 PCR 儀中95℃ 15min 預(yù)變性 1 個循壞95℃ 10s 變性56℃ 20s 退火 40 個循環(huán)72℃ 32s 延伸（4）收集實驗數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。（5）擴增曲線及溶解曲線附圖，如下。
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圖片說明： 95℃ 15min 預(yù)變性 1 個循壞95℃ 10s 變性56℃ 20s 退火 40 個循環(huán)72℃ 32s 延伸（4）收集實驗數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析。（5）擴增曲線及溶解曲線附圖，如下。附圖 1：NOX1 RT-qPCR 擴增曲線及溶解曲線
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 歐陽燦暉;朱萱;張q和;戴穎;陳江;何文華;李博;李弼民;;熊果酸對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA表達的影響[J];世界華人消化雜志;2009年22期

2 戴穎;朱萱;;熊果酸抗實驗性大鼠肝纖維化作用機制的研究[J];江西醫(yī)藥;2008年05期

3 申月明;朱萱;張昆和;謝勇;陳江;戴穎;歐陽燦輝;李弼民;;熊果酸對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響[J];中華肝臟病雜志;2008年04期

4 何文華;李博;朱萱;張q和;李弼民;劉志堅;劉戈云;王劍;;NADPH氧化酶在瘦素誘導(dǎo)肝星狀細胞株HSC-T6產(chǎn)生活性氧中的作用及其機制[J];中華肝臟病雜志;2010年11期

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本文編號：2516078