【摘要】：目的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是慢性自身免疫性疾病,由于免疫紊亂導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊自身肝細(xì)胞所致。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,遺傳易感性和環(huán)境因素是目前較為公認(rèn)的發(fā)病因素。腸道與肝臟有共同的胚胎起源,腸黏膜淋巴細(xì)胞具有防御病原體的作用,肝臟免疫細(xì)胞可防止腸道來源的抗原與毒素刺激。腸道黏膜屏障包括機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障,作為機(jī)體重要防線阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌毒素進(jìn)入。大部分肝硬化患者伴有不同程度腸道黏膜屏障功能受損,門脈高壓使胃腸道缺血缺氧,腸黏膜產(chǎn)生的炎性介質(zhì)和氧自由基增多使黏膜上皮緊密連接破壞,腸道黏膜通透性增加。本研究通過深入分析肝硬化與非肝硬化AIH患者腸道機(jī)械屏障和免疫屏障的變化情況,旨在探索腸黏膜屏障破壞與肝臟免疫性損傷的相關(guān)性,進(jìn)一步分析腸-肝循環(huán)在AIH發(fā)病及疾病進(jìn)展中的作用與因果關(guān)系。此外,我們通過評價AIH患者肝臟巨噬細(xì)胞活化狀態(tài),分析其免疫活動度與肝細(xì)胞損傷程度的關(guān)系及TLR4蛋白與肝臟巨噬細(xì)胞共表達(dá)情況,提出腸源性脂多糖通過TLR4途徑激活巨噬細(xì)胞表達(dá),刺激肝臟免疫異常的假設(shè)。方法第一部分:AIH患者腸道機(jī)械屏障和免疫屏障的變化收集2016年1月至2016年12月就診于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科AIH患者60例(無肝硬化者35例、肝硬化者25例)和健康對照15例,收集外周血標(biāo)本,對三組受試者應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)測定血清D-Lac、DAO含量;收集2016年1月至2016年12月就診于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科AIH患者14例(無肝硬化者6例、肝硬化者8例)和健康對照10例,收集回腸末端黏膜組織標(biāo)本,應(yīng)用Realtime-PCR檢測ZO-1、Occludin、TLR4及炎癥因子表達(dá),應(yīng)用免疫組化法檢測回腸末端黏膜組織巨噬細(xì)胞情況,應(yīng)用Western blot檢測s Ig A蛋白表達(dá)水平的差異以評價腸黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障的改變。第二部分:AIH患者肝臟巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的研究收集2016年1月至2016年12月于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科確診為AIH患者13例(肝功能正常者5例、肝功能異常者8例)和對照者6例。AIH患者通過超聲引導(dǎo)下肝穿刺活檢術(shù)取得肝臟病理標(biāo)本,對照者肝組織為胰腺癌或膽管癌手術(shù)切除的部分正常肝臟標(biāo)本。應(yīng)用免疫組化方法標(biāo)記肝組織巨噬細(xì)胞,以評價肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)與炎癥活動度的關(guān)系。進(jìn)一步通過免疫熒光雙染觀察肝臟巨噬細(xì)胞和Toll樣受體4共表達(dá)情況,評價其與肝臟炎癥活動度的相關(guān)性。結(jié)果第一部分:AIH患者腸道機(jī)械屏障和免疫屏障的變化1.AIH肝硬化患者回腸末端組織部分腺體結(jié)構(gòu)破壞,黏膜微絨毛結(jié)構(gòu)受損,局部可見少量隱窩膿腫形成;無肝硬化AIH患者較健康對照組相比腸黏膜形態(tài)欠規(guī)整,局部見輕度炎細(xì)胞浸潤。2.ELISA法比較血清D-Lac水平,AIH患者均有升高[無肝硬化組:(386.1±297.3)μg/L,肝硬化組:(1423.2±409.4)μg/L,健康對照組:(98.6±10.2)μg/L],其中AIH肝硬化患者升高更顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.049,P0.01);比較血清DAO水平,AIH患者均有升高[無肝硬化組:(6.1±2.3)U/m L,肝硬化組:(11.7±2.7)U/m L,健康對照組:(3.7±1.1)U/m L],AIH肝硬化患者較健康對照組相比升高更顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.983,P0.01);此外,血清D-Lac、DAO水平均與WBC、Hgb、PLT呈明顯負(fù)相關(guān)(P0.01),且D-Lac與DAO升高水平顯著相關(guān)(r=0.722,P0.01)。3.Realtime-PCR示AIH患者回腸末端黏膜ZO-1相對表達(dá)量均顯著低于健康對照組[肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.20±0.14)vs(1.67±0.51),P0.01;無肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.99±0.37)vs(1.67±0.51),P0.05];AIH患者較健康對照組相比Occludin表達(dá)量減少,但無肝硬化AIH患者無統(tǒng)計學(xué)意義[肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.12±0.09)vs(0.90±0.21),P0.01;無肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.64±0.30)vs(0.90±0.21),P=0.057]。4.CD68免疫組化染色示AIH患者回腸末端黏膜巨噬細(xì)胞數(shù)量增多:與對照組相比,AIH肝硬化患者每高倍鏡視野的絕對計數(shù)表達(dá)顯著增加(P0.05),無肝硬化AIH患者表達(dá)增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057)。5.Realtime-PCR示AIH患者腸黏膜組織中促炎細(xì)胞因子相對高表達(dá):AIH肝硬化患者腸黏膜IL-2、IFN-γ相對表達(dá)量均顯著高于健康對照組[IL-2:(1.11±0.43)比(0.24±0.16),IFN-γ:(3.50±1.92)比(0.32±0.30),P值均0.01]。無肝硬化AIH患者中,IL-2相對表達(dá)量有升高趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.1628),而IFN-γ相對表達(dá)量的升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0622)。抑炎細(xì)胞因子相對低表達(dá):AIH患者較健康對照組相比回腸末端黏膜組織IL-10相對表達(dá)量均減少[肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.30±0.19)vs(0.74±0.23),P0.05;無肝硬化AIH患者vs健康對照組:(0.42±0.24)vs(0.74±0.23),P0.05],IL-4相對表達(dá)量有下降趨勢,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義[肝硬化AIH患者vs健康對照組:(1.01±0.58)vs(1.45±0.31),P=0.0584;無肝硬化AIH患者vs健康對照組:(1.13±0.54)vs(1.45±0.31),P=0.1548]。6.Realtime-PCR示AIH患者回腸末端黏膜組織TLR4相對表達(dá)水平升高,AIH肝硬化患者較對照組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異[(6.74±5.13)vs(0.89±0.70),t=3.596,P0.01],無肝硬化AIH患者TLR4表達(dá)水平有增加趨勢且差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(3.74±3.65)vs(0.89±0.70),t=2.455,P=0.028]。7.Westernblot檢測各組回腸末端黏膜組織s Ig A蛋白表達(dá)水平:AIH肝硬化患者s Ig A蛋白水平明顯降低(P0.05),而無肝硬化AIH患者s Ig A表達(dá)水平有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.238)。第二部分:AIH患者肝臟巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的研究1.AIH患者CD68陽性細(xì)胞絕對數(shù)均顯著增多,其中肝酶升高AIH患者CD68表達(dá)增加明顯(P=0.032),肝酶正常AIH患者巨噬細(xì)胞表達(dá)數(shù)量也增加(P=0.041),CD68在炎性細(xì)胞聚集區(qū)域表達(dá)更為明顯。2.免疫熒光雙染法標(biāo)記CD68與TLR4以觀察其共表達(dá)情況:與健康對照組相比,AIH患者TLR4定位于CD68陽性細(xì)胞計數(shù)每高倍鏡視野明顯增多,隨著肝酶增高其表達(dá)數(shù)量存在增加趨勢(肝酶正常AIH組:P=0.037,肝酶升高AIH組:P=0.028)。結(jié)論1.AIH患者腸道黏膜形態(tài)改變,黏膜機(jī)械屏障破壞、免疫屏障異常,AIH肝硬化患者較無肝硬化差異更加顯著。2.AIH患者巨噬細(xì)胞表達(dá)增多,TLR4與巨噬細(xì)胞共表達(dá),且與肝臟炎癥活動度相關(guān)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 圖 1 單中心 16 年回顧性研究自身免疫性肝病首診臨床特點（A）不同類型診斷例數(shù)均逐年上升；（B）不同性別患者平均首診年齡可見明顯下降趨勢；（C）因體檢篩查發(fā)現(xiàn)肝功能異常而就診的無癥狀患者比例逐年增多；（D）首診合并肝硬化或影像學(xué)出現(xiàn)肝硬化征象的患者比例逐年降低。圖 2 腸道與肝臟之間雙向作用的簡化示意圖[13]
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圖片說明： 圖 1 單中心 16 年回顧性研究自身免疫性肝病首診臨床特點（A）不同類型診斷例數(shù)均逐年上升；（B）不同性別患者平均首診年齡可見明顯下降趨勢；（C）因體檢篩查發(fā)現(xiàn)肝功能異常而就診的無癥狀患者比例逐年增多；（D）首診合并肝硬化或影像學(xué)出現(xiàn)肝硬化征象的患者比例逐年降低。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2513774