本文關(guān)鍵詞：Ⅳ型豬源HEV熒光定量PCR檢測(cè)及其體外細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《揚(yáng)州大學(xué)》 2014年

Ⅳ型豬源HEV熒光定量PCR檢測(cè)及其體外細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立

朱嘉磊  

【摘要】：戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染引起的病毒性肝炎癥,具有急性病毒性肝炎的臨床和流行病學(xué)特征,其臨床癥狀與甲型肝炎相似。急性戊型肝炎患者一般發(fā)病期為3至4周左右,期間除了體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平升高之外,一般不產(chǎn)生明顯的并發(fā)癥。但研究也表明,急性戊型肝炎對(duì)孕婦具有威脅。孕婦在妊娠期內(nèi),感染急性戊型肝炎的概率要大于其他人群,因其導(dǎo)致的流產(chǎn)率接近20%。免疫力低下的患者感染HEV后能夠發(fā)展為慢性戊型肝炎。有些慢性戊型肝患者因肝臟快速纖維化而出現(xiàn)肝硬化,并最終導(dǎo)致肝功能衰退甚至肝臟衰竭。 現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn),戊型肝炎病毒共分為4種基因型,其中Ⅳ型HEV能普遍感染人和牲畜,在衛(wèi)生條件差或飲水問(wèn)題嚴(yán)重的地區(qū)極易大規(guī)模爆發(fā)和流行,對(duì)社會(huì)造成巨大和健康隱患和經(jīng)濟(jì)損失。為了對(duì)Ⅳ型HEV更好的進(jìn)行檢測(cè)和生物學(xué)活性研究,本文做了兩方面的研究： 研究一根據(jù)GenBank收錄的多株Ⅳ型豬HEV ORF2保守基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,建立起一套Ⅳ型HEV SYBR Green Real-time RT-PCR方法,并對(duì)其穩(wěn)定性,特異性及靈敏度做了相關(guān)分析,同時(shí)與常規(guī)的巢式PCR(或稱nested-RT-PCR)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)、組內(nèi)重復(fù)性Ct值變異系數(shù)(CV%)和組間重復(fù)性Ct值變異系數(shù)(CV%)均符合要求,顯示該方法具有良好的穩(wěn)定性。且與傳統(tǒng)的巢式PCR相比,本研究所建立的熒光定量PCR方法能更好的運(yùn)用于對(duì)Ⅳ型豬HEV的檢測(cè)和定量研究。 研究二為獲得單一的、高純度的Ⅳ型豬HEV病毒液,本研究將豬戊型肝炎急性期內(nèi)的Ⅳ型HEV陽(yáng)性糞便懸液經(jīng)快速離心和過(guò)濾后感染人肝癌細(xì)胞(smmc-7721),進(jìn)行病毒毒株的純化與擴(kuò)增,成功的建立起一套穩(wěn)定的Ⅳ型豬HEV體外細(xì)胞培養(yǎng)體系。接種陽(yáng)性糞便懸液的細(xì)胞在接毒后發(fā)生大量凋亡并裂解,并發(fā)現(xiàn)人肝癌smmc-7721細(xì)胞系支持Ⅳ型豬HEV的增值。對(duì)不同初始病毒接種量下HEV的增值趨勢(shì)分析顯示,在一定條件和范圍內(nèi),HEV初始接種量越大,病毒的增值速度越快,增值效率也越高。此外對(duì)Ⅳ型豬HEV毒株進(jìn)行了7次持續(xù)的傳代培養(yǎng),細(xì)胞上清液中HEV的拷貝量最高可在接毒后第72天增值至2.05×107copies/mL。與傳統(tǒng)的HEV體外細(xì)胞培養(yǎng)體系相比,本研究根據(jù)人肝癌smmc-7721細(xì)胞所建立的體外培養(yǎng)體系能更好的應(yīng)用于對(duì)Ⅳ型豬HEV進(jìn)行大量的、持續(xù)的培養(yǎng)。 通過(guò)本研究,初步構(gòu)建起一套較為穩(wěn)定的Ⅳ型豬HEV熒光定量PCR檢測(cè)及其體外細(xì)胞培養(yǎng)體系,能在檢測(cè)對(duì)Ⅳ型豬HEV進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí),對(duì)HEV在smmc-7721細(xì)胞中的增值進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量。本研究對(duì)戊型肝炎的檢測(cè)與防治具有積極的意義,也利于對(duì)在分子水平對(duì)HEV展開(kāi)進(jìn)一步的研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.6
【目錄】：

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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8 李震;朱于敏;董世娟;周宗清;;戊型肝炎與獸醫(yī)公共衛(wèi)生[A];第3屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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3 屈勇剛;戊型肝炎病毒流行病學(xué)及其感染機(jī)理探索研究[D];吉林大學(xué);2008年

4 陸一涵;中國(guó)華東地區(qū)基因Ⅳ型戊型肝炎病毒人畜共患與進(jìn)化起源研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

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2 張西營(yíng);豬感染戊肝病毒后體內(nèi)抗體與抗原相關(guān)性及病毒準(zhǔn)種現(xiàn)象研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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4 張序;豬戊型肝炎病毒RT-nPCR方法的建立及SHEV-JX株的分離[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 曹文兵;新疆羊戊型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查及HEV ORF2-62基因的克隆表達(dá)[D];石河子大學(xué);2009年

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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4 張曉峰;帥江冰;李愛(ài)云;方維煥;何永強(qiáng);吳珊;;豬戊型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其分子流行病學(xué)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年06期

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本文編號(hào)：250818