【摘要】：在人類中,Notch信號(hào)通路有五個(gè)配體(Jagged1,Jagged2,Delta-like配體1(D111),D113和Dll4). Notch受體和配體在各種人體組織里都有表達(dá),其中也包括肝臟組織。Alagille綜合征是一種小葉間膽管發(fā)育不良的累及多系統(tǒng)的顯性遺傳性疾病,Jagged1基因突變被證實(shí)是導(dǎo)致Alagille綜合征的病因。但是有趣的是,Alagille綜合征患者不會(huì)發(fā)展成明顯的纖維化。此外,在病變肝臟的新生小血管和膽管中發(fā)現(xiàn)Jagged1和Notch3過(guò)表達(dá),例如原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC).這些研究表明,Notch信號(hào)通路可能通過(guò)參與新生異常血管和膽道反應(yīng),與門脈周圍纖維化過(guò)程相關(guān)。然而,Notch配體在肝纖維化進(jìn)展中的作用仍不清晰。 第一部分Notch信號(hào)通路在慢性HBV感染患者中的表達(dá)變化 方法(1)為了探討Notch受體和配體的表達(dá)水平與肝纖維化形成機(jī)制的關(guān)聯(lián)性,采用免疫組化檢測(cè)10例HBV感染后肝硬化的肝組織和5例對(duì)照組的肝組織中的Notch配體(Jagged1, Jagged2, Dll1, D113和D114)和受體(Notch1,2,3和4)表達(dá)情況。在肝纖維化激活的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)和肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFBs)的關(guān)鍵機(jī)制中,需要進(jìn)一步明確Notch受體和配體是否存在于激活的HSCs和MFBs中。通過(guò)雙染技術(shù)研究Notch受體／配體和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA,激活的HSCs或者M(jìn)FBs標(biāo)記物)。(2)為了判斷Notch信號(hào)通路和肝臟疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性,通過(guò)免疫組化顯示113例HBV感染患者的肝臟組織的D114和Notch1的表達(dá)水平。 結(jié)果(1)免疫組化顯示在HBV感染后肝硬化的肝組織中Notch配體Jagged1,D113和D114以及受體Notchl,2,3和4呈強(qiáng)陽(yáng)性染色,然而在對(duì)照組的肝組織中呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。在這些已知的Notch受體和配體中,Jaggedl, D114和Notchl在肝竇細(xì)胞中呈陽(yáng)性染色。共聚焦顯微鏡顯示表明在肝硬化組織的激活的HSCs和MFBs中強(qiáng)烈表達(dá)D114和Notch1。(2)在非肝硬化的HBV感染患者中,Notch1染色陽(yáng)性主要集中在膽管上皮細(xì)胞。然而,有趣的是,僅有HBV感染的肝硬化患者,Notch1染色陽(yáng)性表達(dá)在肝竇細(xì)胞中。進(jìn)一步評(píng)估不同疾病程度的HBV感染患者中肝竇細(xì)胞和匯管區(qū)的Notch1和D114的表達(dá)水平顯示,D114的免疫組化評(píng)分與炎癥分級(jí)(r=0.6,p0.0001)以及纖維化分級(jí)(r=0.68,p0.0001)呈顯著相關(guān)性。這些結(jié)果表明,在HBV慢性感染中,D114可能與炎癥和／或纖維化呈相關(guān)性。 結(jié)論(1)慢性HBV感染的肝硬化患者中,Notch配體D114和受體Notchl在激活的HSCs和MFBs中明顯表達(dá)。(2)在113例HBV感染患者中,D114的免疫組化評(píng)分與炎癥分級(jí)以及纖維化分級(jí)呈顯著相關(guān)性。 第二部分rD114的體內(nèi)注射對(duì)CCh誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型的影響 方法將18只C57BL/6小鼠按照體重隨機(jī)分為3組(每組6只)：空白組、CC14組和CCl4+rD114組。在CC14組,腹腔內(nèi)注射CCl4(0.5ml/kg,按1：4稀釋于橄欖油中,每周注射兩次),連續(xù)4周。在CCl4+rD114組,腹腔內(nèi)注射CC14的同時(shí),每周兩次注射6.25μg的rD114,連續(xù)4周。在空白組,腹腔內(nèi)僅注射與CC14組同等劑量的橄欖油。在最后一次腹腔內(nèi)注射CC14后,留取全血標(biāo)本并頸椎脫臼處死小鼠。 結(jié)果(1)rD114的注射顯著的升高了肝臟Hes1和Hes5的mRNAs(Notch信號(hào)通路的直接的兩個(gè)靶基因)的表達(dá)水平,這表明在肝臟中Notch信號(hào)通路被rD114激活。在rD114治療后,CC14誘導(dǎo)的小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平明顯下降。組織學(xué)上,rD114治療后顯著降低肝臟纖維化和肝臟中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞水平。與病理組織學(xué)結(jié)果一致,實(shí)時(shí)定量PCR顯示rD114治療顯著降低CC14誘導(dǎo)的肝臟膠原蛋白1a1和α-SMA的mRNA的表達(dá)水平。此外,rD114治療后,CC14誘導(dǎo)的羥脯氨酸含量也明顯下降。(2)除了纖維化相關(guān)指標(biāo)以外,進(jìn)一步評(píng)估rD114對(duì)CC14誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥的影響。HE染色顯示rD114治療顯著降低CC14誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR比較檢測(cè)rD114治療與非治療CC14誘導(dǎo)的小鼠肝臟中一系列炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子,包括TNF-α, IFN-γ,IL-1α,IL-2, IL-4, IL-6, IL-10,IL-12a,IL-13和TGF-β1。rD114的治療顯著抑制了CCl4誘導(dǎo)的TNF-α,IL-6,IL-10和IFN-y的mRNA表達(dá)水平(P0.05),而對(duì)IL-1α和IL-12α的mRNA的表達(dá)水平并沒(méi)有明顯的影響(p0.05)。另外,兩組中IL-2,IL-4和IL-13的mRNA表達(dá)水平都非常低。接著,進(jìn)一步探討rD114對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。F4/80,S100A4和CD45分別是巨噬細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞的炎癥細(xì)胞的標(biāo)記物。免疫組化分析表明CCl4誘導(dǎo)的這三種炎癥細(xì)胞隨著rD114的治療明顯下降。另外,rD114的治療不能改變TGF-p1的mRNA的表達(dá)水平,但是,可以導(dǎo)致了p-Smad2表達(dá)水平的下降(TGF-β信號(hào)通路激活的標(biāo)記物)。這些結(jié)果表明rD114可能直接通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而改善CC14誘導(dǎo)的肝纖維化模型。 結(jié)論體內(nèi)注射rD114蛋白可明顯改善四氯化碳誘導(dǎo)小鼠的肝損傷,炎癥和纖維化程度。 第三部分rD114處理培養(yǎng)的HSCs對(duì)其纖維化相關(guān)因子的影響 方法(1)通過(guò)使用GSI(一種Notch信號(hào)通路抑制劑),評(píng)估Notch信號(hào)通路在體外大鼠原代HSCs和纖維化貯脂細(xì)胞(cirrhotic fat storing cells, CFSCs)中的作用。另外,應(yīng)用Adeasy cloning系統(tǒng)(Quantum, Heidelberg, Germany)獲得(CAGA)9-MLP-Luc的重組腺病毒,CFSCs高度增殖感染后,通過(guò)1β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白標(biāo)記重組病毒進(jìn)行評(píng)估。一般的,90%以上的CFSCs被感染。24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基,感染后將感染細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)血清但含0.5%FCS的DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜和第二天進(jìn)行刺激。(2)接著,探討培養(yǎng)的HSCs和CFSCs中D114的影響。rD114處理原代大鼠HSCs和CFSCs,進(jìn)一步檢測(cè)纖維化相關(guān)因子水平。另外,在CFSCs中采用RNAi技術(shù)阻斷D114：轉(zhuǎn)染前一天,細(xì)胞接種在24孔板上,0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量,應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90%；在50μL的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基加入20pmo1siRNA,柔和混勻；混勻SiMi Transfection Reagents試劑,用50μL無(wú)血清的DMEM稀釋1μL SiMi Transfection Reagents試劑,輕輕混勻,室溫放置5分鐘；將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合；輕柔混勻,室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物；將100μL siRNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中,來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板；細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后,進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。 結(jié)果(1)在原代HSCs中GSI的處理降低了膠原蛋白I的mRNA的基礎(chǔ)水平,也抑制了TGF-β介導(dǎo)的膠原蛋白I的mRNA的上調(diào)。在CFSCs中,GSI的治療可以阻止TGF-β介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF),α-SMA和膠原蛋白1α1l蛋白的上調(diào)。而且,GSI的處理顯示GSI對(duì)TGF-p誘導(dǎo)的Ad(CAGA)9-MLPLuc受體基因激活的顯著抑制效果,這表明Notch信號(hào)通路的阻斷可以影響經(jīng)典的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在GSI存在情況下,IL-13刺激α-SMA蛋白表達(dá)可以被完全阻斷。這些結(jié)果表明,Notch信號(hào)通路促進(jìn)HSCs中促纖維化基因的表達(dá)。(2)rD114處理原代大鼠HSCs,發(fā)現(xiàn)可以抑制TGF-β誘導(dǎo)膠原蛋白lal的mRNA的表達(dá),但是無(wú)論在大鼠還是小鼠HSCs中不能影響α-SMA的mRNA的表達(dá)。在蛋白水平,在CFSCs中,rD114的處理降低了TGF-β誘導(dǎo)的CTGF的表達(dá),但是對(duì)α-SMA蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。在CFSCs中采用RNAi技術(shù)阻斷D114導(dǎo)致增強(qiáng)了TGF-β依賴的CTGF的表達(dá),然而并沒(méi)有影響α-SMA的表達(dá)水平。 結(jié)論(1)Notch信號(hào)通路的阻斷可以影響經(jīng)典的TGF-p信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(2)Notch信號(hào)通路促進(jìn)HSCs中促纖維化基因的表達(dá)。(3)體外rDll4處理培養(yǎng)的HSCs,發(fā)現(xiàn)可抑制TGF-β誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和CTGF的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.2

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