【摘要】：目的：原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是威脅人類健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，導(dǎo)致肝癌發(fā)生的原因很多。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是導(dǎo)致HCC發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。全球約有1.7億人感染HCV，其中80%的成年患者將發(fā)展成慢性丙型病毒性肝炎，進(jìn)而進(jìn)展為肝纖維化，肝硬化甚至肝癌。原發(fā)性肝癌病死率高，其中一個(gè)主要原因是腫瘤惡性程度高，較早發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前許多實(shí)驗(yàn)支持HCV編碼的蛋白，尤其是核心蛋白在HCV相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮主要的作用，同時(shí)還參與HCC的惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程，但其具體機(jī)制不明。 上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）的過(guò)程是上皮細(xì)胞受到刺激后，失去粘著蛋白（E-cadherin）對(duì)細(xì)胞之間的緊密連接，上皮細(xì)胞基底膜極性被破壞，細(xì)胞之間變得疏松，并進(jìn)一步獲得間質(zhì)樣細(xì)胞特有的應(yīng)力纖維（fibronectin）、波形蛋白（vimentin），，細(xì)胞最終具有遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。以往研究者對(duì)EMT的認(rèn)識(shí)多集中在胚胎發(fā)育期，即EMT在正常的胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如EMT參與中胚層、心臟發(fā)育及神經(jīng)嵴的形成。近年來(lái)EMT參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲得到廣泛關(guān)注，有研究報(bào)道顯示，在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌以及黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)EMT參與腫瘤的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移。但是EMT參與HCV感染相關(guān)的原發(fā)性肝癌惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程的具體機(jī)制仍不清楚。 發(fā)生上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變（EMT）的細(xì)胞表型改變主要包括：細(xì)胞遷移能力、侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡受到抑制。EMT的典型分子標(biāo)志物包括：上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞重要指標(biāo)vimentin，N-cadherin，fibronectin表達(dá)增加，β-catenin出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位；與此同時(shí)調(diào)控E-cadherin表達(dá)的抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，如Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、E47等。 粘著蛋白E-cadherin是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的功能蛋白。當(dāng)缺失E-cadherin時(shí)，細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力都顯著增加，而回復(fù)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表現(xiàn)為上皮表型，同時(shí)細(xì)胞的遷移能力降低；除此之外，異位表達(dá)的E-cadherin，可以使間質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。因此，E-cadherin的表達(dá)缺失被視為EMT發(fā)生的重要標(biāo)志。 研究顯示SNAIL轉(zhuǎn)錄因子超家族Snail通過(guò)識(shí)別保守的5’-CAGGTG-3’序列，直接與E-cadherin(CDH1)啟動(dòng)區(qū)上的E-box結(jié)合，負(fù)性調(diào)控CDH1啟動(dòng)子活性，進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)。最新研究表明，肝癌組織中E-cadherin的低表達(dá)與Snail負(fù)相關(guān)，腫瘤組織中高表達(dá)Snail，肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后較差。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明：體外肝癌細(xì)胞模型中HCV核心蛋白能夠下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，但是HCV核心蛋白能否通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在進(jìn)一步探討核心蛋白調(diào)控E-cadherin表達(dá)的分子機(jī)制及參與肝癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移的作用。 方法：采用細(xì)胞劃痕、遷移實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、Western blot、免疫熒光及siRNA干擾技術(shù)驗(yàn)證HCV核心蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞由上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，分析HCV核心蛋白誘導(dǎo)EMT進(jìn)程的相關(guān)信號(hào)通路。進(jìn)一步采用基因重組技術(shù)構(gòu)建E-cadherin(CDH1)啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告質(zhì)粒及CDH1啟動(dòng)子區(qū)E-box突變報(bào)告質(zhì)粒，分析HCV核心蛋白對(duì)CDH1啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用；通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation, ChIP）、免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）方法研究核心蛋白調(diào)控CDH1基因的分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)裸鼠肝癌皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型，研究HCV核心蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。進(jìn)一步采用HE染色和免疫組化方法檢測(cè)裸鼠肝臟原位移植瘤模型中Core、Snail、E-cadherin以及侵襲相關(guān)分子VEGF，MMP-2，MMP-9的表達(dá)。 結(jié)果：在瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的Huh7細(xì)胞中， HCVCore下調(diào)上皮細(xì)胞重要標(biāo)志物E-cadherin，增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin的表達(dá)，引起肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，此現(xiàn)象同時(shí)在HCV體外復(fù)制模型中得到驗(yàn)證。核心蛋白過(guò)表達(dá)的Huh7細(xì)胞中，回復(fù)E-cadherin的表達(dá)可以部分阻斷HCV Core誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，說(shuō)明HCV Core誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生與細(xì)胞中E-cadherin的缺失表達(dá)密切相關(guān)。進(jìn)一步研究HCV Core誘導(dǎo)EMT發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，HCV Core對(duì)調(diào)控EMT常見(jiàn)信號(hào)通路TGF-β無(wú)明顯激活作用，其通過(guò)激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路，增加Snail的穩(wěn)定性，從而抑制E-cadherin的表達(dá)，引起肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。 HCV Core介導(dǎo)Snail結(jié)合于CDH1啟動(dòng)子區(qū)的E-box1（-80~-75），E-box3（-30~-25），E-box4（+22~+27），抑制CDH1的啟動(dòng)子活性，其中發(fā)揮主要負(fù)性調(diào)控作用的是E-box1、3，并且兩者之間具有協(xié)同作用。深入分析發(fā)現(xiàn)：HCV Core可以增強(qiáng)Snail結(jié)合于CDH1啟動(dòng)子區(qū)，同時(shí)Core還可以與Snail形成復(fù)合物，共同結(jié)合于CDH1啟動(dòng)子區(qū)，抑制E-cadherin的表達(dá)。因此，在過(guò)表達(dá)核心蛋白的Huh7細(xì)胞中證實(shí)：HCV Core能與Snail直接結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。 裸鼠肝癌皮下移植瘤模型發(fā)現(xiàn)：HCV Core通過(guò)穩(wěn)定Snail，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)MMP-2、MMP-9、VEGF等的表達(dá)，促進(jìn)異位移植瘤的生長(zhǎng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。肝臟原位移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HCV Core能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)發(fā)生廣泛性轉(zhuǎn)移，部分裸鼠發(fā)生肺部的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。采用siRNA技術(shù)特異沉默Snail表達(dá)，可以明顯降低HCV Core誘導(dǎo)的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。E-cadherin的表達(dá)明顯回復(fù)，MMP-2、MMP-9以及VEGF表達(dá)顯著下調(diào)。體內(nèi)皮下移植瘤模型和肝臟原位移植瘤模型的結(jié)果證實(shí)：HCV Core增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而沉默Snail的表達(dá)可以明顯抑制Core促腫瘤增殖與遷移效應(yīng)，充分說(shuō)明Core促腫瘤效應(yīng)依賴轉(zhuǎn)錄因子Snail的參與。 結(jié)論：我們通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCV Core通過(guò)激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子Snail，從而下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)HCV感染相關(guān)肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。從正反兩方面證實(shí)HCV Core通過(guò)與Snail結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，參與HCV誘導(dǎo)EMT進(jìn)程的一種新的分子機(jī)制，揭示了Core促腫瘤效應(yīng)依賴于轉(zhuǎn)錄因子Snail的參與，為闡明HCV感染相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的理論依據(jù)，為HCV感染相關(guān)肝癌的靶向治療奠定了重要的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.63;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

本文編號(hào)：2280911