本文關鍵詞：酒精性脂肪肝形成過程中肝細胞脂肪性病變的機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學》 2012年

酒精性脂肪肝形成過程中肝細胞脂肪性病變的機制

王冬梅  

【摘要】：研究背景： 在上世紀中葉,人們對酒精引起的脂肪肝就有所認識,長期大量飲酒可導致酒精肝,這種效應對長期飲酒者可達99%以上。但對其機制的認識與研究主要放在脂肪代謝與能量平衡的生化角度上去論述,對酒精引起脂肪肝的發(fā)病原因和途徑遠沒有弄清楚。在脂肪肝形成過程中,大量的肝細胞可轉分化為脂細胞,這將嚴重影響肝臟的解毒功能,繼而會影響神經、腎臟的功能,其后果非常嚴重,更嚴重的是脂肪肝會進一步發(fā)展成酒精性肝炎、肝硬化,甚至肝癌。我們國家飲酒的人日益增多,長期飲酒所引發(fā)的肝性疾病給個人、家庭及社會都造成了很大的負擔。我們只有弄清楚酒精肝的發(fā)病機制,才能真正找到預防的措施,為酒精性脂肪肝的治療提供實驗和理論基礎。因此,此研究具有實際意義。 研究目的： 通過體外細胞實驗,分別原代培養(yǎng)非分離純化肝臟細胞和分離純化肝細胞,通過形態(tài)學、細胞化學、分子學等檢測方法,觀察酒精處理實驗組與正常對照組相比較肝細胞發(fā)生的各種變化,進而探討酒精引起肝細胞脂肪性病變的機制,為研究酒精性肝病的治療藥物及臨床酒精性肝病的防治提供實驗依據(jù)。 研究方法： 以體外原代培養(yǎng)5天齡KM乳小鼠肝細胞為實驗材料,進行下列實驗： 1.采用胰蛋白酶組織消化法體外原代、貼壁培養(yǎng)乳小鼠肝臟細胞； 2.原代培養(yǎng)乳小鼠肝臟細胞,細胞分離液分離純化,獲得單一、高純度的肝細胞； 3.實驗分組：實驗分為肝細胞未分離純化原代培養(yǎng)(第1組)與分離純化原代培養(yǎng)(第Ⅱ組)兩大組,每大組均設置正常對照組和酒精處理實驗組(設50、100、200、300、400mmol／L5個酒精處理濃度)； 4.形態(tài)學觀察未分離純化原代培養(yǎng)中的細胞類型及分離純化后的肝細胞； 5.細胞化學PAS糖原染色法鑒定兩大組中的肝細胞； 6.免疫細胞化學染色法鑒定兩大組中的Kupffer細胞； 7.油紅0染色法檢測酒精處理兩大組細胞之后,肝細胞發(fā)生脂肪變性的程度,并用異丙醇萃取油紅0染液后,酶標儀測定波長在510nm處的吸光度值定量分析脂肪變性的程度； 8.酒精處理兩大組細胞之后,TR工zol裂解細胞提取總RNA.RT-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳,ImageJ軟件對電泳圖譜進行定量分析,檢測PPAR α與PPAR γ mRNA活性水平的變化； 9.酒精處理兩大組細胞之后,TRIzol裂解細胞提取總RNA.RT-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳,ImageJ軟件對電泳圖譜進行定量分析,檢測免疫因子TNF—α與IL-6mRNA活性水平的變化。 結果： 1.形態(tài)學觀察：倒置相差顯微鏡下,未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細胞有多種種類；分離純化后得到單一、純度較高的肝實質細胞(肝細胞)。肝細胞呈球形、橢圓形或多邊形,邊界清晰,胞質色淡,胞核位于正中,為單核或雙核；Kupffer細胞體積較大,呈球形或橢圓形；星形細胞呈不規(guī)則形,邊緣伸展出偽足。 2.PAS糖原鑒定：將原代培養(yǎng)的細胞種于飛片上,PAS染色后,倒置相差顯微鏡下可以觀察到肝細胞胞質內由于含有大量的糖原顆粒而顯示紅色。未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細胞只有一部分細胞顯示紅色,而分離純化后幾乎90%以上的細胞顯示紅色。 3. KuDffer細胞鑒定：采用免疫細胞化學染色的方法,選用KuDffer細胞表面特異性抗原分子CD68做標志性染色,熒光顯微鏡下觀察到Kupffer細胞表面由于特異性抗原分子CD68的存在而顯示紅色。未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細胞中有一小部分細胞顯示紅色,而分離純化后幾乎沒有細胞顯示紅色。 4.油紅0染色鑒定脂肪細胞：采用細胞化學染色的方法,對酒精處理后的兩大組細胞染色,油紅0為脂溶性染料,在脂肪內能高度溶解,可特異性使組織內的甘油三酯等中性脂肪著色,被染成紅色。未經分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細胞,酒精處理、油紅0染色后部分細胞胞質內顯示紅色,相比較,分離純化的肝細胞酒精處理、油紅0染色后幾乎很少有細胞胞質內顯示紅色。 5. PPAR α與PPAR γ mRNA活性水平的變化：用ImageJ圖像分析軟件分析PCR擴增后的電泳圖譜,其mRNA相對表達量的分析結果顯示： 1)第1組,實驗組不同酒精處理濃度PPAR α的mRNA活性水平分別與正常對照組相比較,結果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,有降低的趨勢；實驗組不同酒精處理濃度PPARγ的mRNA活性水平分別與正常對照組相比較,結果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,有升高的趨勢； 2)第Ⅱ組,各比較結果表現(xiàn)為差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6.免疫因子TNF-α與IL-6mRNA活性水平的變化：用ImageJ圖像分析軟件分析PCR擴增后的電泳圖譜,其mRNA相對表達量的分析結果顯示： 1)第1組,實驗組不同酒精處理濃度TNF-α與IL-6m的RNA活性水平分別與正常對照組相比較,結果表現(xiàn)為差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著酒精處理濃度的升高,TNF-α與IL-6mRNA活性水平均有升高的趨勢： 2)第Ⅱ組,各比較結果表現(xiàn)為差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論： 1.本研究選用5d齡的KM乳小鼠作為實驗材料,它是獲取肝臟細胞的理想材料; 2.本研究采用胰蛋白酶組織消化、貼壁培養(yǎng)法進行體外原代培養(yǎng)肝臟細胞,并采用細胞分離液、適當?shù)碾x心條件成功獲得純度較高的肝細胞； 3.本實驗對脂肪細胞的鑒定選用油紅0染色的方法,并用異丙醇萃取油紅0染液測定波長在510nm處的吸光度值,對脂肪變性進行定量分析； 4.經酒精處理后,與分離純化原代培養(yǎng)的肝細胞相比較,未分離純化原代培養(yǎng)的肝臟細胞,發(fā)生了肝細胞向脂肪細胞轉變的現(xiàn)象；PPAR α的mRNA活性水平較其正常對照組(沒有用酒精處理)有明顯的降低；而PPAR γ、TNF-α及IL-6的mRNA活性水平較其正常對照組有明顯的升高； 5.純化的肝細胞不易形成脂細胞；酒精處理肝臟細胞時,可能是肝臟中的肝細胞在非實質細胞及其產生的因子(包括免疫因子)的作用下發(fā)生了肝細胞脂肪變性即去分化或轉分化的現(xiàn)象。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.5
【目錄】：

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