【摘要】：目的構(gòu)建可調(diào)控性尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)誘導(dǎo)表達系統(tǒng)并進行相關(guān)鑒定,可為進一步構(gòu)建可誘導(dǎo)型肝臟人源化u PA-SCID動物模型奠定基礎(chǔ)。方法可調(diào)控性u PA誘導(dǎo)表達系統(tǒng)即在強力霉素(doxycycline,Dox)誘導(dǎo)下通過tet-on系統(tǒng)調(diào)控u PA表達。為此,需要構(gòu)建兩個重組質(zhì)粒,分別為p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green,前者引入Gaussia熒光素酶(gaussia enzyme fluorescent element,Gluc)與四環(huán)素反式激活因子(reverse tetracycline transactivator,rt TA)偶聯(lián)表達,以便于監(jiān)測rt TA表達水平;后者同時偶聯(lián)表達Zs Green,以便于用熒光顯微鏡觀察基因表達。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行表達功能鑒定后,將構(gòu)建質(zhì)粒與病毒包裝衣殼蛋白VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細胞系后獲得具有感染能力的病毒顆粒,利用該病毒感染NIH/3T3細胞,并用G418篩選出陽性細胞;期間各取部分細胞,使用PCR方法鑒定其基因組內(nèi)是否含有相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控本。結(jié)果成功構(gòu)建p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆。功能鑒定顯示,p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA克隆可表達rt TA;p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆轉(zhuǎn)染Hep G-Tet-on細胞,加Dox可誘導(dǎo)u PA表達。包裝病毒感染NIH/3T3細胞后通過G418篩選獲得單細胞克隆,通過PCR方法鑒定表明其基因組內(nèi)含有相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本,從而成功構(gòu)建u PA誘導(dǎo)表達穩(wěn)定細胞株。結(jié)論本研究初步建立了可調(diào)控性u PA誘導(dǎo)表達系統(tǒng),從而為可誘導(dǎo)肝損的u PASCID轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及在此基礎(chǔ)上的肝臟人源化動物模型的建立奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct and identify the regulated urokinase plasminogen activator (urokinase-type plasminogen activator PA) -induced expression system, which can be used as a basis for the further construction of the induced liver human U PA-SCID animal model. Methods the regulated expression system of u PA was induced by doxycycline dox (doxycycline dox). The expression of u PA was regulated by tet-on system. For this purpose, two recombinant plasmids, p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA and p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green, were constructed. The former introduced Gaussia luciferase (gaussia enzyme fluorescent element Gluc) coupled with the tetracycline transactivator (reverse tetracycline transactivator RTTA) in order to monitor the expression level of rtTA. The latter was coupled to express Zs Greenin in order to observe the gene expression by fluorescence microscope. After the expression function of the recombinant retroviral vector was identified, the constructed plasmid was co-transfected with the VSV-G plasmid of the viral capsid protein into the GP2-293 packaging cell line to obtain the viral particles with the ability to infect the NIH/3T3 cells, and the virus was used to infect the NIH/3T3 cells. The positive cells were screened by G418, and some of the cells were selected during the period, and the PCR method was used to identify whether there was a corresponding gene transcription regulator in the genome. Results the cloning of p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA and p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green was successfully constructed. Functional identification showed that ttTAP LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green clone could be transfected into Hep G-Tet-on cells by LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA clone, and UPA expression could be induced by adding Dox. Single cell clones were obtained by G418 screening after the packaging virus was infected with NIH/3T3 cells, and the corresponding transcripts were identified by PCR method, and the stable cell lines induced by UPA were successfully constructed. Conclusion the regulatory expression system of u PA was established in this study, which laid a foundation for the construction of u PASCID transgenic mice with induced liver damage and the establishment of humanized animal model of liver on this basis.
【作者單位】： 上海市公共衛(wèi)生臨床中心;蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院;復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部衛(wèi)生部重點實驗室;
【基金】：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2012CB519005) 上海市科技發(fā)展基金實驗動物研究項目(12140900300) 上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(20144Y0073) 上海市公共衛(wèi)生臨床中心中心科研課題面上項目(2014M08)
【分類號】：R-332;R575

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本文編號：2142129