本文關(guān)鍵詞：我國(guó)流行C基因型野生和耐藥HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》 2013年

我國(guó)流行C基因型野生和耐藥HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系的建立及應(yīng)用

王琳  

【摘要】：研究背景 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染呈世界性流行，不同地區(qū)流行強(qiáng)度不同，，近30年來(lái)預(yù)防性乙肝疫苗的廣泛使用使得我國(guó)成為HBV中度流行性區(qū)，但是對(duì)于約9300萬(wàn)感染者含2000萬(wàn)慢性乙型肝炎患者的現(xiàn)狀，治療方面仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于乙肝病毒基因組序列的高度異質(zhì)性，可將其分為9種主要基因型（A-I），各類基因型病毒的生物學(xué)特性、對(duì)藥物的反應(yīng)性、疾病進(jìn)展和臨床轉(zhuǎn)歸都不同，我國(guó)最常見的是基因型B和C，是我國(guó)HBV患者易進(jìn)展成為肝纖維化、肝衰竭和罹患肝細(xì)胞癌的原因之一。 當(dāng)前，慢乙肝治療的總體目標(biāo)是：最大限度地長(zhǎng)期抑制HBV，減輕炎癥和纖維化，延緩疾病進(jìn)展及并發(fā)癥的發(fā)生。核苷（酸）類藥物（NAs）是臨床最常用的抗HBV感染治療藥物，拉米夫定（lamivudine, LAM）、恩替卡韋（entecavir, ETV）、替比夫定（tebivudine, LdT）和阿德福韋酯（adefovir dipivoxil, ADV）四種已在我國(guó)上市，替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）仍處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，它們直接作用于HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）區(qū)，可顯著抑制病毒的復(fù)制卻無(wú)法清除肝細(xì)胞內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀D(covalently closed circular DNA, cccDNA)。因此，長(zhǎng)期抗病毒治療雖然抑制了病毒復(fù)制，但預(yù)存于準(zhǔn)種群中的極少量變異株在藥物壓力下獲得選擇性擴(kuò)增引起病毒突破，導(dǎo)致治療失敗。 建立細(xì)胞模型是研究病毒感染史、生物學(xué)特性，評(píng)價(jià)藥物療效，優(yōu)化治療方案，研發(fā)新藥疫苗高效便捷的技術(shù)手段。病毒感染類細(xì)胞模型，由于HBV種屬和組織特異性要求嚴(yán)格，培養(yǎng)條件苛刻，對(duì)病毒敏感度低，應(yīng)用受限。以肝癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)的病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)難以維持病毒穩(wěn)定長(zhǎng)期的復(fù)制，不適于需要標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)，如藥敏實(shí)驗(yàn)。20余年來(lái)國(guó)內(nèi)外建立了一些可以復(fù)制和分泌HBV病毒顆粒的穩(wěn)定細(xì)胞系，如世界公認(rèn)的HepG2.2.15細(xì)胞；其他一些實(shí)驗(yàn)室為滿足抗病毒耐藥變異研究的需求，相繼建立了耐藥突變HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞株。但是現(xiàn)有成熟細(xì)胞模型存在一些問(wèn)題：首先是穩(wěn)定性不高，同時(shí)難以模擬自然復(fù)制狀態(tài)；其次缺少我國(guó)流行的B和C基因型毒株穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系；另外人為誘導(dǎo)突變細(xì)胞株，不能反應(yīng)病毒的自然遺傳特征。直接從中國(guó)乙肝患者血清分離克隆野生型或者含有耐藥突變位點(diǎn)的HBV全長(zhǎng)基因組序列，建立中國(guó)流行的基因型穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞模型，對(duì)于抗病毒藥物評(píng)價(jià)及防治方案的本土化具有積極作用。 本研究旨在建立我國(guó)流行HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞模型，基因來(lái)源于中國(guó)患者流行的C基因型HBV分離株，利用病毒與HepG2肝癌細(xì)胞系基因整合方法獲得具有代表性的不同耐藥形式的穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系，期望能夠用于各種核苷和核苷酸類似物的藥敏實(shí)驗(yàn)分析，為抗HBV新藥藥效評(píng)價(jià)提供理想的細(xì)胞模型。 目的 建立中國(guó)患者流行的C基因型野生、恩替卡韋耐藥變異和多重耐藥變異HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系，能夠支持HBV長(zhǎng)期高水平復(fù)制并穩(wěn)定表達(dá)病毒抗原和分泌完整病毒顆粒，并應(yīng)用于藥物體外抑制HBV作用評(píng)價(jià)。 方法 (1)本研究血清樣本來(lái)源于解放軍第302醫(yī)院確診的慢性乙型肝炎患者，提取HBVDNA，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT）/表面抗原（S）區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和雙向測(cè)序分析，根據(jù)RT/S區(qū)序列應(yīng)用MEGA4軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹分析并分型，對(duì)其中3例具有代表性的C基因型HBV（野生株wt、恩替卡韋耐藥株ETVr、多重耐藥株MDR）進(jìn)行全長(zhǎng)基因擴(kuò)增、測(cè)序和全長(zhǎng)克隆，根據(jù)病毒序列特征設(shè)計(jì)引物，逐步克隆至pCDNA3.1(+)以及pTriEx-mod真核表達(dá)載體上，得到1.38倍體及1.1倍體HBV重組復(fù)制子，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。以新霉素G418篩選具有抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，對(duì)分泌到上清中的HBV DNA進(jìn)行全長(zhǎng)PCR鑒定。 (2)檢測(cè)分泌上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）以及HBV DNA，保留高表達(dá)細(xì)胞株，將其有限稀釋以獲得單一細(xì)胞來(lái)源的穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系。通過(guò)ELISA、免疫組化方法檢測(cè)病毒主要抗原水平；通過(guò)Southern印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞HBV復(fù)制中間體核心顆粒DNA和培養(yǎng)上清中分泌的病毒DNA載量；以滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合跨缺口實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA，評(píng)估穩(wěn)定細(xì)胞克隆的復(fù)制表達(dá)情況；通過(guò)透射電鏡觀察證實(shí)細(xì)胞分泌乙肝病毒顆粒。 (3)用目前常見核苷（酸）類似物： LAM、ETV、ADV及TDF四種藥物進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)各細(xì)胞株實(shí)際應(yīng)用效果。 結(jié)果 (1)構(gòu)建C基因型1.38倍HBV野生株以及1.1倍ETVr和MDR表達(dá)載體分別為pN31-51-6-1、pTriEX-1.1-63-2、pTriEX-1.1-37-17，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染篩選和亞克隆，獲得相應(yīng)的穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞克隆分別命名為HepG2.51-6-1、HepG2.A64和HepG2.1403F，培養(yǎng)上清全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與原病毒序列完全一致。 (2) HepG2.51-6-1（1.38wt）、HepG2.A64（1.1ETVr）、HepG2.1403F（1.1MDR）建系后具有高抗原表達(dá)和穩(wěn)定復(fù)制能力，分別傳代60代（29個(gè)月）、400代（44個(gè)月）和260代（29個(gè)月）；平均HBsAg/HBeAg吸光度值為3.25±0.41/3.13±0.47、1.83±0.78/1.32±0.63和2.24±0.74/1.0~8±0.26；免疫組化染色直觀可見細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的表達(dá)。平均HBV DNA復(fù)制水平（分泌上清/核心顆粒）分別為4.53×10~5/4.57×10~7拷貝/ml、1.77×10~5/7.41×10~7拷貝/ml和2.63×10~5/2.34×10~8拷貝/ml；cccDNA分別為9.6、22和6.8個(gè)/細(xì)胞；Southern blot結(jié)果顯示存在病毒復(fù)制中間體的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)、雙鏈DNA(double strands DNA，dsDNA)和單鏈DNA（single strand，ssDNA）三條清晰顯影帶。透射電鏡下觀察可見到42nm左右大顆粒和20nm左右小球型顆粒。 (3)細(xì)胞株HepG2.51-6-1對(duì)于四種藥物均敏感；HepG2.A64對(duì)ETV具有高水平的耐藥性，同時(shí)存在LAM交叉耐藥，對(duì)ADV和TDF仍然敏感；HepG2.1403F對(duì)LAM、ETV和ADV耐藥，對(duì)TDF敏感。表型耐藥分析符合耐藥特征。 結(jié)論成功建立了中國(guó)患者流行的C基因型野生、恩替卡韋耐藥變異和多重耐藥變異HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系HepG2.51-6-1、HepG2.A64和HepG2.1403F，能夠支持HBV長(zhǎng)期高水平復(fù)制并穩(wěn)定表達(dá)病毒抗原和分泌完整病毒顆粒。我們建立的細(xì)胞模型改變了一直依賴國(guó)外建立的D基因型HepG2.2.15細(xì)胞的局面，這些細(xì)胞系為我國(guó)HBV病毒學(xué)及抗病毒研究提供新的工具。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62;R392.12
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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3 尹兵;俞道進(jìn);李健;羅小青;薛日雄;邱偉娟;黃一帆;;豬源萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌的篩選及耐藥表型、基因型測(cè)定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十次研討會(huì)論文摘要集[C];2009年

4 丁柳;劉顯中;陸小軍;應(yīng)斌武;;中國(guó)成都地區(qū)乙肝病毒(HBV)高復(fù)制人群HBV基因型分布研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

5 商紅艷;程祖建;歐啟水;;建立PCR熔解曲線法檢測(cè)HBV基因型[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 李冬冬;王軍;陸小軍;謝軼;應(yīng)斌武;陶傳敏;王蘭蘭;;四川漢藏兩族乙肝攜帶者HBV基因型分布與肝酶的關(guān)系研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

7 任巧晶;王魯文;龔作炯;;HBV基因型與阿德福韋酯抗病毒療效的關(guān)系[A];全國(guó)第3屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)傳染病專業(yè)委員會(huì)第2屆委員會(huì)議論文匯編[C];2010年

8 肖代雯;喻華;傳良敏;楊永長(zhǎng);劉華;黃文芳;廖維金;胡琦;;產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌表型及基因型分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

9 劉壽榮;武靜;翁慧斌;劉雁;曾艷梅;張素英;陳蓉;張忠東;孟婭妮;;HBV陽(yáng)性孕婦DC-SIGN/DC-SIGNR基因多態(tài)性與宮內(nèi)感染的關(guān)系研究[A];第四屆中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)感染科醫(yī)師大會(huì)暨傳染病診治高峰論壇、浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)肝病、感染病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

10 李長(zhǎng)纓;李建忠;周蓉蓉;李曉斐;胡彬;趙林;;慢性HBV感染者干擾素治療應(yīng)答與KIR基因型相關(guān)性研究[A];中國(guó)輸血協(xié)會(huì)第五屆輸血大會(huì)論文專集（摘要篇）[C];2010年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉云濤;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

2 中原;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

3 吳一福;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

4 ;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

5 周菁;[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

6 張永琇;[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

7 記者 郭靜 通訊員 朱增彥;[N];廣東科技報(bào);2008年

8 郭新秀;[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

9 李靜;[N];山西科技報(bào);2003年

10 李躍軍 周旭婭;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張愛民;中國(guó)HBV基因型分布特點(diǎn)和臨床意義及慢加急性肝衰竭患者HBV基因突變的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

2 唐景峰;乙肝病毒耐藥及致癌突變的高靈敏檢測(cè)新技術(shù)研究[D];武漢大學(xué);2011年

3 石曉東;IL28B基因多態(tài)性及其表達(dá)與HCV、HBV感染轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究[D];吉林大學(xué);2011年

4 Edward Zumbika;HBV感染的肝病患者HBV基因型和HBV X 基因選擇性突變的研究[D];浙江大學(xué);2005年

5 趙攀;核苷（酸）類似物抗HBV感染的臨床研究以及病毒耐藥突變對(duì)其免疫原性的影響[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

6 李慶虹;基于臨床信息的新發(fā)傳染病診療系統(tǒng)與基于遺傳信息的HBV個(gè)體化診療信息系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

7 葉新平;乙醇相關(guān)氧化應(yīng)激在廣西原發(fā)性肝癌發(fā)病及經(jīng)皮無(wú)水酒精注射治療反應(yīng)性中的作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2007年

8 王晶;FMO3基因型和膽堿對(duì)雞蛋三甲胺含量影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

9 何群;HBV基因芯片的制備及其在臨床應(yīng)用的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2005年

10 湯影子;核苷類似物干預(yù)下慢性乙型肝炎患者臨床療效及HBV變異與進(jìn)化規(guī)律的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李淑珍;乙型肝炎病毒基因型及“a”決定簇變異與HBV宮內(nèi)傳播關(guān)系的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

2 趙麗;反向雜交快速檢測(cè)HBV基因型方法的建立及臨床應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

3 楊軍;成都地區(qū)乙型肝炎患者HBV基因型分布特點(diǎn)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

4 劉琦;HBV基因型及前C區(qū)變異與慢性乙型肝炎病情關(guān)系研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

5 徐麗;HBV基因型、變異、p53基因與HCC相關(guān)性的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

6 王琳;我國(guó)流行C基因型野生和耐藥HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系的建立及應(yīng)用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

7 吳珍萍;拉米夫定耐藥后補(bǔ)救治療中HBV準(zhǔn)種的演變及耐藥模式的特點(diǎn)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

8 趙文瑾;HBV基因分型芯片的構(gòu)建及臨床初步應(yīng)用[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

9 吳淋玲;廣西桂北地區(qū)慢性HBV感染不同免疫狀態(tài)與HBV基因型研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2011年

10 黃文鋒;HJURP基因多態(tài)性與HBV相關(guān)性肝癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：我國(guó)流行C基因型野生和耐藥HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：213077