本文選題：日本血吸蟲 + 肝纖維化��； 參考：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：[背景及目的] 肝臟是人體內(nèi)血流極為豐富的器官之一,也承載著解毒、消化及分泌功能,因此肝臟極易受到各種因素?fù)p傷,如嗜肝細(xì)胞病毒、淤積膽汁、酒精、某些藥物、細(xì)菌、寄生蟲感染、代謝性疾病、自身免疫性疾病等等。肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種急慢性肝病慢性遷延轉(zhuǎn)歸的中間環(huán)節(jié),是機(jī)體對慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病的共有病理變化,其病生基礎(chǔ)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化,合成分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),破壞了正常肝小葉結(jié)構(gòu)。血吸蟲病是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家的重要寄生蟲病之一。我國曾是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國家之一,盡管目前通過有效的藥物(吡喹酮)控制了流行范圍,但我國長江流域及其南部的7個省(市、區(qū))仍受血吸蟲感染的威脅。慢性血吸蟲病對機(jī)體造成的損害以血吸蟲病肝纖維化最為突出。血吸蟲蟲卵沉積于肝臟門脈系統(tǒng)并分泌可溶性蟲卵抗原,激活HSCs,大量ECM沉積,最終發(fā)展為血吸蟲病肝纖維化。由于肝纖維化病理過程的進(jìn)展,在晚期往往表現(xiàn)為肝臟質(zhì)地變硬,失代償期還伴有脾臟腫大,門脈高壓腹水形成。 參與肝纖維化形成的始動因素主要是肝細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞聚集,參與的細(xì)胞主要包括竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝細(xì)胞以及HSCs(又稱貯脂細(xì)胞)。其中心環(huán)節(jié)是HSCs在各種介導(dǎo)因子如轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)以及表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)等,最終結(jié)果導(dǎo)致ECM合成與降解失衡,ECM大量沉積,肝纖維化形成。在對肝纖維化機(jī)制的研究中,以始動因素HSCs的活化為重點(diǎn),分別從HSCs增殖、遷移、細(xì)胞因子的分泌以及ECM的合成與降解等方面進(jìn)行研究。 表氧化二十碳三烯酸(EpoxyeicosatrienoicAcids, EETs)是花生四烯酸(ArachidonicAcid, AA)經(jīng)細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)表氧化酶代謝途徑產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)。AA是生物體內(nèi)多種重要的心血管活性物質(zhì)的前體,其主要以酯化形式存在于細(xì)胞膜的內(nèi)表面,在脂解激素作用下由磷脂酶A2水解釋放至細(xì)胞漿內(nèi)�，F(xiàn)今已對AA研究多年,對下游的環(huán)氧化酶和脂質(zhì)氧化酶代謝途徑的研究較為多見,近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AA還可通過細(xì)胞色素P450途徑代謝(即AA代謝的第三條途徑),經(jīng)表氧化酶代謝產(chǎn)生四種EETs (5,6-,8,9-,11,12-和14,15-EET)。EETs降解主要由可溶性表氧化水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)控制,可生成相對應(yīng)的具有弱生物活性的二羥基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),可通過抑制sEH酶的活性顯著增加EETs的體內(nèi)含量,延長其生物學(xué)作用。 表氧化酶代謝途徑產(chǎn)物EETs,最初在心血管及腎臟系統(tǒng)中被廣泛研究,并發(fā)現(xiàn)EETs具有舒張血管、抑制血小板的聚集、抑制血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及平滑肌細(xì)胞的遷移、增強(qiáng)纖維蛋白溶解,以及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與新生血管形成等作用。EETs的生物學(xué)作用涉及面廣,作用多樣,對不同組織來源的細(xì)胞,生物學(xué)作用不一樣,前期有研究發(fā)現(xiàn),EETs可以通過抑制ERKI/2的去磷酸化和激活PI3K/AKT信號通路,減輕腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF-a)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡；通過抑制核因子NF-kB的核轉(zhuǎn)位,或者通過抑制NF-kB的天然抑制物IkB的磷酸化抑制炎癥細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附,減少組織中炎癥細(xì)胞浸潤；通過激活cAMP-PKA途徑,抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移�；贓ETs的生物學(xué)多樣性,學(xué)者們逐漸將EETs與器官纖維化的發(fā)病機(jī)制聯(lián)系起來,有研究表明CYP2J2表氧化酶基因及其代謝產(chǎn)物EETs通過抑制了巨噬細(xì)胞向心肌遷移,減少TGF-β1分泌,上調(diào)MMP-2的表達(dá),有效地抑制了KKAy糖尿病小鼠心肌纖維化,延緩心肌重構(gòu)。此外,在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中,予以sEH酶抑制劑治療后,可明顯抑制肺成纖維細(xì)胞增殖、分化及膠原合成,控制肺纖維化進(jìn)展。以上研究說明EETs在心、肺等器官中具有抗纖維化的作用,雖然目前具體機(jī)制尚不明了,但為器官纖維化發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路和方向。 肝纖維化也是器官纖維化之一,由于反復(fù)的炎癥損傷,釋放趨化因子募集激活的HSCs遷移至炎癥病灶,是肝臟發(fā)生纖維化的重要環(huán)節(jié)。盡管在早期的炎性損傷時,EETs具有顯著的抗炎效應(yīng)和抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移的功能,但在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中的功能尚未明確,尤其對肝纖維化關(guān)鍵環(huán)節(jié)——活化HSCs的作用,尚未見報道。我們前期工作,成功建立血吸蟲性肝纖維化模型,并發(fā)現(xiàn)肝纖維化病程中趨化HSCs遷移的因子PDGF、TGF-β1、MCP-1等表達(dá)明顯上調(diào),同時HSCs的骨架結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯改變,如運(yùn)動蛋白表達(dá)上調(diào)、F-actin聚集增多,為研究EETs在血吸蟲性肝纖維化中的作用,提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此,我們提出假設(shè)：EETs可通過抑制慢性炎癥損傷、阻止HSCs活化遷移,從而改善血吸蟲病纖維化。 我們擬在建立血吸蟲性肝纖維化小鼠動物模型基礎(chǔ)上,對病程中肝臟EETs的含量及下游sEH進(jìn)行檢測分析；之后,采用sEH酶特異性抑制劑TPPU處理小鼠,內(nèi)源性增加EETs含量,觀察肝纖維化病程進(jìn)展并探索相關(guān)機(jī)制。在體外,觀察EETs對PDGF誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化遷移的影響,進(jìn)一步論證體內(nèi)相關(guān)機(jī)制,以期為肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的理論依據(jù)和策略。 具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜缦拢?1.以血吸蟲性肝纖維化動物模型為研究對象： 1).研究血吸蟲性肝纖維化病程中EETs (11,12-,14,15-)在肝臟組織中含量的變化,及下游代謝酶sEH在病程中的動態(tài)改變,初步確定EETs在肝纖維化中的生物學(xué)效應(yīng)。 2).采用sEH酶特異性抑制劑TPPU內(nèi)源性增加血吸蟲性肝纖維化小鼠體內(nèi)EETs含量,進(jìn)一步探討EETs與血吸蟲性肝纖維化病程的關(guān)系及其相關(guān)分子機(jī)制。 2.以PDGF誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞遷移模型為研究對象： 1).在動物模型試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,詳細(xì)探討EETs各同分異構(gòu)體的作用差異,以及作用肝纖維化發(fā)病機(jī)制的具體環(huán)節(jié)。 2).在明確了具體環(huán)節(jié)基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步探討其可能的信號分子途徑。 [方法] 1.實(shí)驗(yàn)動物操作程序按照NIH實(shí)驗(yàn)動物管理與使用指南進(jìn)行,以及以中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)范所制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 1).6周齡SPF級balb/c小鼠16只,體重20-23g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為兩組：對照組(8只)和感染組(8只)。感染組用購自岳陽市血防所的血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染小鼠(22±1條/只),感染后觀察12w。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：提前1h,將釘螺放入清水中,待尾蚴游出。小鼠以1%戊巴比妥進(jìn)行腹腔注射麻醉,然后將小鼠固定于無菌操作臺上,腹部朝上,于下腹部備皮約lcmxlcm大小,做好相應(yīng)防護(hù)工作。取疫水兩滴至蓋玻片上,隨即于顯微鏡下觀察并對尾蚴進(jìn)行計(jì)數(shù),此后,將蓋玻片有疫水一側(cè)蓋在小鼠備皮處,計(jì)時15min。然后取下玻片,待小鼠清醒,整個過程將小鼠置于溫室中完成。對照組處理過程一樣,僅將疫水換用生理鹽水代替。所有小鼠在感染4周時,予以吡喹酮250mg/kg連續(xù)灌胃3d,以驅(qū)蟲治療。感染后12w,實(shí)驗(yàn)結(jié)束處理小鼠,留取肝臟標(biāo)本并攝片,留取相應(yīng)的血液及組織標(biāo)本備用。 2).6周齡SPF級balb/c小鼠48只,體重20-23克,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為6組：8w control(8只)、8w infected(8只)、8w sEHi-treated(8只)、12w control(8只)、12winfected(8只)、12w sEHi-treated(8只)。infected和sEHi-treated建立血吸蟲感染模型如上所述,此外,sEHi-treated組小鼠在感染血吸蟲尾蚴后第6w,用sEH特異性抑制劑TPPU進(jìn)行干預(yù)。具體方法如下：TPPU每日予以小鼠灌胃,按2.5mg/kg/day體重進(jìn)行,每日灌胃量約0.2ml,將TPPU溶于生理鹽水中,并加以聚乙二醇400(PEG400)作為助溶劑和穩(wěn)定劑。同時infected組予以同等體積的生理鹽水和PEG400混合液同時灌胃處理,每日擬定于早10點(diǎn)進(jìn)行。于感染的第8w和12w分別處理小鼠,收集標(biāo)本并留取照片記錄,相應(yīng)的血液及組織標(biāo)本留取備用。 2.各組小鼠處理前,稱取體重并做好記錄,處理后,分別取肝脾組織測量最長直徑并稱取重量,血液標(biāo)本離心取上清進(jìn)行生化指標(biāo)(ALT、AST)檢測。 3.稱取各組小鼠取冰凍肝組織100mg用組織裂解液裂解后取上清,用ELISA方法分別檢測酸化前和酸化后11,12-/14,15-DHET含量,兩者的差值為組織中EET的濃度,并分析11,12/14,15-EET和sEH的表達(dá)。 4.各組小鼠肝組織石蠟切片行HE染色、Masson染色以觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化,膠原沉積情況和分布。 5.部分小鼠肝組織冰凍切片行a-SMA, Fascin運(yùn)動蛋白熒光共聚焦染色。 6.檢測小鼠肝組織中HSCs活化相關(guān)指標(biāo)和內(nèi)源性增加EETs對HSCs活化的影響：real-time PCR檢測HSCs活化標(biāo)志物(a-SMA、Desmin、Vimentin),HSCs遷移能力及細(xì)胞骨架改變(Fascin、Dynein、Dynactin),膠原合成和降解平衡(collagenI、collagen Ⅲ、 MMP-9、TIMP-1); Western-blot檢測-SMA和Fascin蛋白表達(dá)水平；ELISA方法檢測影響HSCs遷移的MCP-1、ICAM-1表達(dá)水平。 7.體外建立由PDGF誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞遷移系統(tǒng)。用僅含4%胎牛血清的DMEM(高糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)LX-2細(xì)胞,將培養(yǎng)瓶水平置于37℃,含5%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞呈指數(shù)增長,單層細(xì)胞大約80%匯合時,棄掉培養(yǎng)基,無菌PBS清洗一次。再改用含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)饑餓過夜,次日用0.25%胰蛋白酶消化傳代至Transwell小室,每孔細(xì)胞數(shù)4×103。在小室下方加入適量的含0.1%胎牛血清的DMEM,并向液體中加入終濃度為lOng/ml的人源性PDGF細(xì)胞因子。 8.觀察EETs對PDGF誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞遷移的影響時,細(xì)胞在傳代至Transwell小室后,先用EETs (四種同分異構(gòu)體)1uM或者LY294002預(yù)先處理細(xì)胞30min,再如上所述加入PDGF細(xì)胞因子,分別于12h、24h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 9. Real-time PCR檢測處理后LX-2細(xì)胞a-SMA、Desmin、Vimentin、collagenI、collagen Ⅲ、Fascin的表達(dá)；Western-blot檢測a-SMA、Fascin、PI3k/Akt磷酸化；免疫共聚焦檢測細(xì)胞骨架微絲蛋白、Fascin、a-SMA蛋白的表達(dá)情況。 [結(jié)果] 1.成功建立血吸蟲并肝纖維化小鼠模型,12w時肝組織HE染色顯示感染組小鼠肝組織匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞胞漿疏松,羽毛狀變性,伴有點(diǎn)狀壞死或嗜酸性壞死,匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤及蟲卵肉芽腫形成,膠原纖維分布于蟲卵肉芽腫及匯管區(qū)周圍。Masson染色顯示感染組小鼠肝組織中有大量膠原纖維沉積。 2. ELISA檢測肝組織中11,12-/14,15-EET的含量,11,12-EET在感染組肝組織(43.69±9.07pg/ug protein)中較對照組(79.67±7.05pg/ug protein)明顯減少(P0.05),14,15-EET在感染組(9.54±1.70pg/ug protein)的濃度比對照組(14.34±1.97pg/ug protein)的濃度低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。用EET與DHET的比值間接反映sEH酶的活性,11,12-EET/11,12-DHET或者14,15-EET/14,15-DHET的比值與sEH酶活性呈反比,感染組中sEH酶活性均明顯增高(P0.05)。 3.血吸蟲病肝纖維化小鼠經(jīng)sEH抑制劑TPPU干預(yù)處理后,組織大體觀及形態(tài)學(xué)改變測定如下：肝脾整體取材后觀察：control組肝臟色澤紅潤,表面光滑,脾臟色紅,邊緣銳利；infected組肝臟呈墨綠色,明顯膽汁淤積,表面可見似肉芽腫乳白色斑點(diǎn),質(zhì)地較硬,脾臟腫大,色深,邊緣變鈍；sEHi-treated組肝臟暗紅色,質(zhì)地較control組硬,脾臟大小介于control組與sEHi-treated組之間。對比肝(脾)/體重指數(shù)發(fā)現(xiàn)12w時sEHi-treated組的肝指數(shù)(0.068±0.008)、脾指數(shù)(0.009±0.001)較infected組中肝指數(shù)(0.096±0.007)、脾指數(shù)(0.015±0.002)明顯下降(P0.05)。進(jìn)行肝組織HE染色后行蟲卵肉芽腫直徑測定得出,sEHi-treated組肉芽腫直徑在8w(0.44±0.03cm)和12w (0.61±0.04cm)時較infected組8w (0.71±0.04cm)、12w (0.73±0.04cm)明顯縮小(P0.05),而Masson染色后分析膠原面積百分比,sEHi-treated組在8w(21.77±7.87%)和12w(30.25±8.06%)時較infected組(24.83±6.35%)、(45.20±10.49%)有所減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.經(jīng)TPPU灌胃處理后,取小鼠肝臟勻漿裂解后提取上清,ELISA法分別檢測肝組織中酸化前和酸化后的11,12-/14,15-DHET含量,經(jīng)計(jì)算得出干預(yù)組中8w時11,12-EET (83.30±12.66pg/ug protein)及12w時(79.02±20.55pg/ug protein)較infected組(29.51±5.36pg/ug protein)明顯升高(P0.05);14,15-EET在干預(yù)組中8w時(32.63±6.38pg/ug protein),12w時(32.83±7.22pg/ug protein)較infected組(14.27±1.969pg/ug protein)亦明顯升高(P0.05)。 5.實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,在感染12w時,HSCs活化相關(guān)基因a-SMA、Desmin和Vimentin在sEHi-treated組中的表達(dá)較infected組明顯下調(diào)(P0.05),同時collagen ImRNA在sEHi-treated組中的表達(dá)亦較infected組減少(P0.05)；與膠原降解平衡關(guān)系密切的酶類,TIMP-1在sEHi-treated組中表達(dá)明顯減少(P0.05),有利于膠原的降解,而MMP-9的表達(dá)在兩組間無明顯差異(P0.05),說明內(nèi)源性增加的EETs對肝纖維化病程的進(jìn)展有多方面的影響。 6.進(jìn)一步分析EETs作用的HSCs活化環(huán)節(jié),Real-time PCR結(jié)果顯示,與HSCs遷移運(yùn)動相關(guān)蛋白Fascin和Dynactin的表達(dá)在sEHi-treated組中較infected組中明顯下調(diào)(P0.05),胞漿動力蛋白Dynein于感染12w時,在sEHi-treated組中亦有下調(diào)趨勢,但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ELISA分析影響細(xì)胞遷移的胞外因素MCP-1和ICAM的表達(dá)水平。于感染后12w時,sEHi-treated組小鼠肝組織中MCP-1的含量(138.1±15.81pg/ug protein)顯著低于infected組(215.1±21.78pg/ug protein)(P0.05),較control組(61.32±6.18pg/ug protein)仍明顯升高(P0.05); ICAM-1在小鼠肝組織中的表達(dá)與MCP-1類似,sEHi-treated組(183.4±16.43pg/ug protein)較infected組(260.1±26.46pg/ug protein)明顯下降(P0.05)。免疫共聚焦檢測并定位HSCs活化標(biāo)志物a-SMA(紅光)和運(yùn)動蛋白Fascin (綠光)的表達(dá)發(fā)現(xiàn),在control組中,a-SMA幾乎不表達(dá),而Fascin僅少量表達(dá)；在infected組中,HSCs活化,a-SMA表達(dá)明顯增多,同時運(yùn)動蛋白Fascin表達(dá)明顯增多,紅綠光重合部分明顯增多,說明肝纖維化時HSCs活化伴隨遷移能力的增強(qiáng)。而在sEHi-treated組中紅綠光重疊的部分較infected組中減少。Western-blot結(jié)果再次驗(yàn)證,在感染12w時,sEHi-treated組較infected組a-SMA和Fascin蛋白均有不同程度的下調(diào)。證明在血吸蟲肝纖維化病程中,內(nèi)源性增加EETs不僅抑制HSCs活化,還抑制與HSCs遷移相關(guān)動力蛋白。 7.體外建立PDGF誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞遷移transwell模型,分別用四種EET同分異構(gòu)體(5,6-；8,9-；11,12-和14,15-EET) luM的濃度預(yù)處理細(xì)胞20min。觀察四種同分異構(gòu)體對PDGF誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞遷移的作用發(fā)現(xiàn),在加入PDGF (10ng/ml)12h時,11,12-EET組發(fā)生遷移的細(xì)胞倍數(shù)與PDGF組相比明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),同時明顯高于與對照組和DMSO組(P0.05)；在24h時進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),11,12-EET和14,15-EET組較PDGF組細(xì)胞遷移倍數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),同時亦高于對照組和DMSO組(P0.05)；5,6-和8,9-EET組無論在12h還是24h,細(xì)胞遷移倍數(shù)明顯高于對照組和DMSO組(P0.05),但較PDGF組無顯著性差異(P0.05)。隨后,分別觀察11,12-EET和14,15-EET在不同時間點(diǎn)對PDGF誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞遷移的影響。結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)后分析發(fā)現(xiàn),2h和6h時EET組細(xì)胞遷移倍數(shù)雖有下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),12h和24h結(jié)果如上所述,48h時EET組與PDGF組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Transwell結(jié)果表明,11,12-與14,15-EET具有抑制PDGF誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞遷移的作用,其中11,12-EET抑制作用最為明顯。 8. Western-blot檢測PDGF刺激5min、10min、30min以及60min時LX-2細(xì)胞中Akt和p-Akt的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)PDGF刺激后,p-Akt的表達(dá)明顯增加,而經(jīng)11,12-EET預(yù)處理的細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)較單純PDGF組減少,說明11,12-EET抑制了PDGF誘導(dǎo)的Akt磷酸化。進(jìn)一步觀察PI3K-Akt信號通路對細(xì)胞遷移的影響發(fā)現(xiàn),11,12-EET與LY249002(P13K抑制劑,10uM)具有相似的作用,二者在PDGF刺激LX-2細(xì)胞12h和24h時可明顯抑制細(xì)胞遷移(P0.05),而11,12-DHET組細(xì)胞遷移倍數(shù)與PDGF組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 9. Real-time PCR檢測細(xì)胞模型中a-SMA以及Fascin表達(dá)水平,結(jié)果提示11,12-EET組與LY249002組較PDGF組a-SMA、Fascin的表達(dá)明顯下調(diào),提示11,12-EET可能通過抑制PI3K-Akt信號通路磷酸化,影響LX-2細(xì)胞的活化遷移能力。同時,免疫共聚焦檢測LX-2細(xì)胞微絲蛋白F-actin(綠光)和運(yùn)動蛋白Fascin (紅光)的表達(dá)發(fā)現(xiàn),微絲蛋白F-actin在PDGF組及11,12-DHET組中多聚集于LX-2細(xì)胞胞漿,且Fascin在胞漿和遠(yuǎn)端突觸表達(dá)明顯,但在11,12-EET組和LY249002組中,F-actin多散在胞漿中,少聚集,突觸部分亦未見明顯聚集,Fascin蛋白表達(dá)明顯減少且多集中于胞漿中。用Western-blot檢測a-SMA和Fascin蛋白的表達(dá)顯示,在11,12-EET組及LY249002組中a-SMA和Fascin蛋白表達(dá)水平較PDGF組和11,12-DHET組明顯下調(diào)。 [統(tǒng)計(jì)學(xué)分析]用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,各分組組間差異采用單因素方差分析(ANOVA),以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)論] 1.在血吸蟲病肝纖維化病程中,11,12-EET和14,15-EET在肝組織中的含量存在動態(tài)變化過程,說明EETs參與了肝纖維化病程的進(jìn)展,隨著纖維化的發(fā)生發(fā)展,EETs在肝組織中的含量有所下降,與其下游代謝酶sEH的活性增加密切相關(guān)。 2.通過每日予以血吸蟲病肝纖維化小鼠口服sEH酶抑制劑TPPU,可內(nèi)源性增加肝臟內(nèi)11,12-和14,15-EET的含量。 3.在感染血吸蟲尾蚴12w(予以TPPU灌胃治療6w)時,EETs的增加可明顯改善肝臟、脾臟的組織形態(tài)學(xué),顯著抑制血吸蟲蟲卵肉芽腫大小,減輕蟲卵周圍炎癥反應(yīng),降低肝脾指數(shù),延緩血吸蟲病肝纖維化的進(jìn)展。 4.EETs延緩血吸蟲病程進(jìn)展的分子機(jī)制可能通過抑制了HSCs活化、遷移,抑制膠原的合成分泌,增加膠原的降解等實(shí)現(xiàn),包括抑制HSC活化標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)的表達(dá)、抑制HSC自身運(yùn)動相關(guān)蛋白(Fascin、Dynactin)的表達(dá)、下調(diào)誘導(dǎo)HSC遷移因子(MCP-1、ICAM)的表達(dá),抑制collagenl表達(dá)和下調(diào)TIMP-1表達(dá)等。 5.外源性加入四種EETs同分異構(gòu)體觀察對PDGF誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞遷移的影響,其中11,12-EET和14,15-EET具有抑制遷移效應(yīng),主要表現(xiàn)在下調(diào)LX-2細(xì)胞自身運(yùn)動蛋白的表達(dá),其可能時通過抑制PDGF誘導(dǎo)的PI3K-Akt信號通路磷酸化實(shí)現(xiàn)。 6.本實(shí)驗(yàn)所取得的研究結(jié)果豐富了肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究思路和內(nèi)容,拓展了EETs的生物學(xué)效應(yīng),為將來肝纖維化的治療提供了新的策略,為藥物開發(fā)和生物學(xué)功能檢測提供了新的理論依據(jù)和研究方向。 總結(jié)：EETs通過抑制HSC活化、遷移,減少膠原合成,增加膠原降解等緩解了血吸蟲性肝纖維化病程的進(jìn)展,11,12-EET部分通過抑制PI3K-Akt磷酸化降低了PDGF對LX-2細(xì)胞的遷移誘導(dǎo)能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2058449