本文選題：Akt1 + 間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文

【摘要】：研究目的： 1.原代培養(yǎng)出小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)并鑒定； 2.構(gòu)建PMSCV-Aktl-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,感染MSCs,并篩選、擴(kuò)增Akt過表達(dá)的MSCs; 3.體外研究過表達(dá)Akt1對(duì)小鼠MSCs生物學(xué)功能的影響； 4.觀察Aktl-MSCs對(duì)不同濃度刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的肝損傷模型的療效。 研究方法： 取C57小鼠脛骨和股骨,利用MSCs的貼壁生長(zhǎng)能力進(jìn)行分離,并對(duì)獲取的細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定和成軟骨和成脂培養(yǎng)；構(gòu)建Aktl-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,感染MSCs,并篩選、擴(kuò)增Aktl過表達(dá)的MSCs,并同時(shí)構(gòu)建GFP-MSCs作為對(duì)照；使用RT-PCR及western blot的方法檢測(cè)Aktl-MSCs的Akt1的基因、蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平；分別用濃度為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ處理Aktl-MSCs及GFP-MSCs細(xì)胞,采用四唑氮化合物(MTS)法測(cè)定MSCs的生長(zhǎng)情況并繪制生長(zhǎng)曲線,通過Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白/碘化丙啶(Annexin V/PI)復(fù)染,觀察不同濃度IFN-γ對(duì)Aktl-MSCs及MSCs細(xì)胞凋亡的影響,并使用pcr-array對(duì)Aktl-MSCs及GFP-MSCs的凋亡信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè),比較兩者的異同；使用RT-PCR的方法檢測(cè)10ng/ml IFN-γ刺激前后Aktl-MSCs及GFP-MSCs中Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的表達(dá)情況；使用ELISA的方法檢測(cè)經(jīng)濃度分別為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ刺激Aktl-MSCs及GFP-MSCs后,培養(yǎng)基中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量；使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治療致死劑量ConA (40mg/kg)所致小鼠急性肝損傷,觀察小鼠的生存情況并繪制生存曲線并了解小鼠肝脾的病理變化；使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治療ConA(20mg/kg)所致的急性肝損傷模型,觀察AST、ALT、TNF-α及IFN-γ的及肝脾病理變化,同時(shí)使用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量并通過活體成像觀察Aktl-MSCs及GFP-MSCs在ConA所致的急性肝損傷模型中向肝臟的歸巢情況。 研究結(jié)果： 成功培養(yǎng)出小鼠MSCs:MSCs高表達(dá)CD29、CD44、Sca-1,而不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD45、CD34,也不表達(dá)CD11b、CD31、FLK-1、MHC-Ⅱ類分子,成功將MSCs誘導(dǎo)分化成為軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞;成功篩選并擴(kuò)增出Akt1-MSCs, RT-PCR顯示Aktl-MSCs的Aktl基因表達(dá)量明顯高于GFP-MSCs(P0.01),Western blot顯示Aktl-MSCs的總Aktl蛋白及磷酸化Akt(Ser473)蛋白均高于GFP-MSCs;細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)顯示在正常培養(yǎng)及高濃度IFN-γ (100ng/ml)的刺激下,Aktl-MSCs顯示出了增殖及抗凋亡優(yōu)勢(shì),PCR-array顯示Akt1-MSCs可顯著抑制外源性凋亡通路；RT-PCR顯示,Aktl-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE-2的基因表達(dá)水平均高于GFP-MSCs,在采用10ng/ml IFN-γ刺激后,Aktl-MSCs及GFP-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、HGF及PGE2的基因表達(dá)水平均有所上調(diào),但Aktl-MSCs上調(diào)幅度更明顯,且VEGF的基因表達(dá)水平未見明顯上調(diào)；分別采用不同濃度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml) IFN-γ刺激Aktl-MSCs及GFP-MSCs后,ELISA結(jié)果顯示：在10ng/ml、50ng/ml IFN-γ刺激12h后,Akt1-MSCs培養(yǎng)基中IL-10濃度明顯高于GFP-MSCs,在100ng/ml IFN-γ刺激12h后,Aktl-MSCs及GFP-MSCs的細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平無明顯差異。在10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ刺激后,細(xì)胞因子PGE-2的含量?jī)烧邿o明顯差異,而Aktl-MSCs培養(yǎng)基中HGF和VEGF的濃度顯著高于GFP-MSCs。由于培養(yǎng)基IL-4濃度過低(各組均4pg/ml),未得出可分性的數(shù)據(jù)；使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治療致死劑量ConA(40mg/kg)所致的小鼠急性肝損傷,小鼠共分為5組,每組10只。24小時(shí)后,ConA40mg/kg、ConA40mg/kg+l×106Akt1-MSCs、ConA40mg/kg+1×106MSCs的三組小鼠均全部死亡,ConA40mg/kg+5×106Akt1-MSCs組存活3只、ConA40mg/kg+5×106MSCs組存活1只。使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治療ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝損傷模型,結(jié)果顯示：與GFP-MSCs相比,Aktl-MSCs可以更好地降低小鼠血清中AST、ALT、TNF-α及IFN-γ水平和改善小鼠肝臟病理損傷情況,其中AST及IFN-γ的降低尤為顯著。Akt1-MSCs治療組小鼠血清中IL-10、VEGF、HGF及的濃度均高于GFP-MSCs治療組小鼠,而由于小鼠血清中IL-4濃度過低(各組均4pg/ml,故未得出可分性的數(shù)據(jù))�；铙w成像結(jié)果顯示,第0天,ConA+Aktl-MSCs組小鼠肝臟GFP熒光強(qiáng)度(465nm)強(qiáng)于ConA+GFP-MSCs組,單純Aktl-MSCs及GFP-MSCs組未檢測(cè)出明顯熒光。第7天,ConA+Aktl-MSCs組小鼠肝臟GFP熒光強(qiáng)度(465nm)局部有所升高,而ConA+GFP-MSCs、Akt1-MSCs及GFP-MSCs組未檢測(cè)出明顯熒光。第14天,Aktl-MSCs組小鼠肝臟GFP熒光強(qiáng)度(465nm)強(qiáng)于MSCs組,而ConA+Akt1-MSCs和ConA+GFP-MSCs組未檢測(cè)到明顯熒光。 研究結(jié)論： 通過本研究,我們1)原代培養(yǎng)出小鼠MSCs,流式細(xì)胞免疫表型鑒定符合MSCs表型表達(dá)特點(diǎn),并將MSCs誘導(dǎo)分化成為軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；2)構(gòu)建PMSCV-Akt1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,感染MSCs,并篩選、擴(kuò)增出出Akt1過表達(dá)的MSCs;3) Akt1-MSCs匕相同代數(shù)的MSCs在正常培養(yǎng)及高濃度IFN-γ (100ng/ml)的刺激下增殖及抗凋亡能力均明顯優(yōu)于GFP-MSCs;4)在lOng/ml IFN-γ刺激前后,Aktl-MSCs的部分細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平高于GFP-MSCs,且Aktl-MSCs表現(xiàn)出對(duì)IFN-γ刺激更強(qiáng)的應(yīng)激能力；5)在不同濃度(lOng/ml、50ng/ml、100ng/ml) IFN-γ刺激12h后,Aktl-MSCs的旁分泌功能優(yōu)于GFP-MSCs;6)5×106Aktl-MSCs可提高致死劑量ConA (40mg/kg)所致的急性肝損傷小鼠的存活率；7)Akt1-MSCs可顯著改善ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝損傷狀況；8)在ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝損傷模型和正常小鼠中,Aktl-MSCs體現(xiàn)出了向肝臟歸巢的優(yōu)勢(shì)。
[Abstract]:Purpose of study :

1 . The bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) were cultured in primary culture and identified ;


2 . constructing the PMSCV - Aktl - to - GFP retroviral vector , infecting MSCs , screening and amplifying the MSCs which are overexpressed ;

3 . The effect of Akt1 on the biological function of MSCs was studied in vitro .


4 . To observe the effect of Aktl - MSCs on the model of liver injury induced by A ( Con A ) in different concentrations .

Study method :

C57 mouse tibia and femur were collected , the adherent growth ability of MSCs was separated , and the obtained cells were subjected to flow identification and chondrosis and adipogenesis culture ;
Construction of the Aktl - EGFP - GFP retroviral vector , infected MSCs , and screened , amplified Aktl over - expressed MSCs , and simultaneously constructed GFP - MSCs as control ;
The expression level of Akt1 gene , protein and phosphorylated protein of Aktl - MSCs was detected by RT - PCR and western blot .
Aktl - MSCs and GFP - MSCs were treated with a concentration of 10 ng / ml , 50 ng / ml , 100 ng / ml IFN - 緯 , and the growth curves of MSCs were determined by MTS . The effects of different concentrations of IFN - 緯 on Aktl - MSCs and the apoptosis of MSCs were observed .
The expression of Akt1 , IL - 4 , IL - 10 , VEGF , HGF and PGE2 in Akt1 , IL - 4 , IL - 10 , VEGF , HGF and PGE2 in 10 ng / ml IFN - 緯 were detected by RT - PCR .
ELISA was used to detect the levels of IL - 4 , IL - 10 , VEGF , HGF and PGE2 in culture medium after stimulation of Aktl - MSCs and GFP - MSCs with concentrations of 10 ng / ml , 50 ng / ml , 100 ng / ml IFN - 緯 .
Using Aktl - MSCs and GFP - MSCs to treat acute liver injury in mice , mice were observed and the survival curves were observed and the pathological changes of liver and spleen were observed .
The acute liver injury model induced by Con A ( 20mg / kg ) was treated with Aktl - MSCs and GFP - MSCs . The changes of AST , ALT , TNF - 偽 and IFN - 緯 and liver and spleen were observed . Meanwhile , ELISA was used to detect the levels of IL - 4 , IL - 10 , VEGF , HGF and PGE2 in serum of mice .

Results of the study :

The expression of Akt1 - MSCs was significantly higher than that of GFP - MSCs ( P0.01 ) .
The expression levels of Akt1 , IL - 4 , IL - 10 , VEGF , HGF and PGE - 2 of Aktl - MSCs were higher than that of GFP - MSCs , and the expression levels of Akt1 , IL - 4 , IL - 10 , HGF and PGE2 in Aktl - MSCs and GFP - MSCs were up - regulated after 10 ng / ml IFN - 緯 stimulation .
The levels of IL - 10 in Akt1 - MSCs were significantly higher than that of GFP - MSCs at 10 ng / ml , 50 ng / ml and 100 ng / ml IFN - 緯 . The levels of HGF and VEGF in Aktl - MSCs were significantly higher than that of GFP - MSCs .
Compared with GFP - MSCs , the levels of AST , ALT , TNF - 偽 and IFN - 緯 in serum of mice were significantly lower than that of GFP - MSCs . The results showed that the levels of AST , ALT , TNF - 偽 and IFN - 緯 in serum of mice were significantly lower than that of GFP - MSCs . In vivo imaging , the fluorescence intensity of liver GFP ( 465 nm ) was stronger than that of Con A + GFP - MSCs group , but only Aktl - MSCs and GFP - MSCs group did not detect the fluorescence . On day 7 , the fluorescence intensity of liver GFP ( 465 nm ) was stronger than that in group A + GFP - MSCs , Akt1 - MSCs and GFP - MSCs . On the 14th day , the fluorescence intensity of liver GFP ( 465 nm ) was stronger than that in MSCs group , while Con A + Akt1 - MSCs and Con A + GFP - MSCs group were not detected .

Conclusions of the study :

In this study , we cultured the MSCs in the primary culture , and the flow cytometry showed that the MSCs differentiated into chondrocytes and fat cells .
( 2 ) Construction of PMSCV - Akt1 2 - GFP retroviral vector , infected MSCs , and screened and amplified the MSCs which were expressed by Akt1 ; 3 ) MSCs of the same algebra as Akt1 - MSCs were significantly better than GFP - MSCs in normal culture and high concentration of IFN - 緯 ( 100 ng / ml ) , and the expression level of partial cytokines of Aktl - MSCs was higher than that of GFP - MSCs , and Aktl - MSCs showed stronger ability to stress IFN - 緯 ;
( 5 ) After 12 hours of IFN - 緯 stimulation at different concentrations ( lOng / ml , 50ng / ml , 100ng / ml ) , the parasecretory function of Aktl - MSCs was better than that of GFP - MSCs ; 6 ) 5 脳 106 Aktl - MSCs could increase the survival rate of mice with acute liver injury induced by Con A ( 40mg / kg ) ;
7 ) Akt1 - MSCs could significantly improve the acute liver injury in mice induced by Con A ( 20mg / kg ) .
8 ) Aktl - MSCs in mice induced by Con A ( 20 mg / kg ) showed the advantage of homing to the liver .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.3

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本文編號(hào)：1833603