本文選題：鈣離子　切入點(diǎn)：BRL細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver diseases, ALD),包括酒精性脂肪肝,酒精性肝炎,酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化,是最常見(jiàn)的肝臟疾病,占肝硬化死亡原因的40%,全部肝臟疾病死亡原因的28%。酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要包括酒精及代謝產(chǎn)物的直接肝臟毒性,酒精誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生及代謝(氧化應(yīng)激),組織缺氧,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,鐵超載,細(xì)胞凋亡及免疫機(jī)制等。然而,酒精性肝病的具體發(fā)病機(jī)制仍然不詳。鈣離子(calcium ion, Ca2+)作為常見(jiàn)的第二信使,參與了許多的細(xì)胞功能,包括能量代謝,細(xì)胞死亡等。鈣池調(diào)控的鈣離子通道(store-operated calcium channels, SOCs)是非興奮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要通道,它是由基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)和鈣釋放激活的鈣通道蛋白1 (calcium release-activated calcium channel protein 1, CRAR,也叫做Orai1)組成。鈣池調(diào)控的鈣離子內(nèi)流(store operated calcium entry, SOCE)與鈣穩(wěn)態(tài)之間關(guān)系密切,可通過(guò)感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子水平,介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流以補(bǔ)充鈣庫(kù),并增加胞漿中鈣離子濃度。前期研究證明乙醇慢性刺激HepG2細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)SOCE相關(guān)蛋白分子的表達(dá)顯著增加細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。然而,盡管HepG2細(xì)胞仍然保留著很多在人類干細(xì)胞中表達(dá)的Ⅰ,Ⅱ階段的酶而被廣泛應(yīng)用于體外肝臟毒性的研究,但HepG2細(xì)胞仍不能完全代表原代肝細(xì)胞。而且,SOCE在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制仍知之甚少。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究SOCE在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制,并且通過(guò)體內(nèi)外阻斷SOCE后觀察其在緩解酒精性肝病中的效果,為深入探討酒精性肝病發(fā)病機(jī)制及尋找治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分：鈣離子在乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷中的作用目的：通過(guò)觀察乙醇刺激之后肝細(xì)胞形態(tài)的變化,檢測(cè)肝細(xì)胞損傷的情況及胞漿中游離鈣離子濃度(cytoplasmic free Ca2+ concentration, [Ca2+]cyt),并給予細(xì)胞內(nèi)外鈣離子螯合劑后,檢測(cè)胞漿中鈣離子濃度的變化,肝細(xì)胞的損傷情況,分析鈣離子在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的作用。方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：正常大鼠肝細(xì)胞BRL細(xì)胞株,給予DMEM (dulbecco's modified eagle's medium)(高糖)和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)BRL細(xì)胞達(dá)到80%—90%融合時(shí)傳代,選擇第4-6代進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞處理分組：BRL細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,種入六孔板中,細(xì)胞貼壁后,分別給予不同刺激,分為0、25mM、50mM、100mM、200mM、400mM不同濃度的乙醇刺激(24小時(shí))組。正常對(duì)照組,乙醇刺激組,乙醇加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)刺激組及乙醇加BAPTA-AM刺激組。3.肝細(xì)胞形態(tài)的觀察：0、50mM、100mM、200mM不同濃度的乙醇刺激細(xì)胞24小時(shí)后,在顯微鏡下觀察BRL大鼠肝細(xì)胞形態(tài)的變化。4.胞漿中鈣離子濃度的檢測(cè)：采用Fluo-3/AM對(duì)細(xì)胞中的鈣離子進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞中游離鈣離子的濃度。5.肝細(xì)胞損傷情況的評(píng)估：采用MTT法檢測(cè)各組中肝臟細(xì)胞的存活率,同時(shí)取各組細(xì)胞上清,通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：1.乙醇對(duì)BRL細(xì)胞形態(tài)的影響：與正常對(duì)照組肝細(xì)胞相比,50mM、100mM、200mM的乙醇刺激24小時(shí)后,大部分的肝細(xì)胞明顯腫脹,并且細(xì)胞呈多角形,部分可見(jiàn)凋亡小體。2.乙醇對(duì)BRL細(xì)胞損傷的影響：0、25mmM、50mM、100mM、200mM、400mM的乙醇濃度依賴性的降低BRL細(xì)胞的存活率,同時(shí)濃度依賴性的升高細(xì)胞培養(yǎng)基上清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的水平,且AST升高較ALT明顯。其中l(wèi)00mM的乙醇刺激后BRL細(xì)胞的存活率為57.58%+2.08%,所以選取100mM(半數(shù)致死量)的乙醇作為下一步的刺激濃度。3.乙醇對(duì)胞漿中游離鈣離子濃度的影響：0、25mM、50mM、100mM、200mM、400mM的乙醇濃度依賴性的升高BRL大鼠肝細(xì)胞中胞漿游離鈣離子的濃度。4.鈣離子螯合劑對(duì)于胞漿中游離鈣離子濃度的影響：細(xì)胞外鈣離子螯合劑EDTA及細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM均可降低胞漿中因乙醇升高的鈣離子濃度,二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。5.鈣離子螯合劑對(duì)于肝細(xì)胞損傷的影響：細(xì)胞外鈣離子螯合劑EDTA及細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM均可升高因乙醇降低的細(xì)胞存活率,降低因乙醇升高的ALT、AST的水平,二者之間無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。結(jié)論：1.乙醇可濃度依賴性的降低BRL細(xì)胞的存活率,升高培養(yǎng)基上清中轉(zhuǎn)氨酶的水平,并增加了胞漿中游離鈣離子的濃度,表明鈣離子可能在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。2.細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子螯合劑均可降低胞漿中游離鈣離子的濃度,減輕肝細(xì)胞的損傷,進(jìn)一步證明鈣離子可能在乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。第二部分：SOCE在乙醇誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制的研究目的：通過(guò)檢測(cè)乙醇刺激后SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的基因及蛋白的表達(dá),并且給予SOCE藥物阻斷劑和shRNA干擾技術(shù)抑制SOCE后,分別檢測(cè)胞漿中游離鈣離子濃度的變化,肝細(xì)胞損傷情況,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外各組細(xì)胞的凋亡率,細(xì)胞周期及線粒體膜勢(shì)能的變化,檢測(cè)肝細(xì)胞胞漿中及線粒體中細(xì)胞色素C(Cytochrome C, CytC)的變化,通過(guò)western blot檢測(cè)各凋亡蛋白的變化,以研究SOCE在乙醇誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。方法：1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、 Orai1的shRNA的序列。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000將合成的針對(duì)STIM1和Orai1的shRNA分別轉(zhuǎn)染到BRL細(xì)胞中,4-6小時(shí)后換液,24小時(shí)后提取蛋白,通過(guò)western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率。2.細(xì)胞處理分組：磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)組、100mM乙醇刺激24小時(shí)組、48小時(shí)組、72小時(shí)組；PBS組、100mM乙醇、乙醇+科羅索酸組、乙醇+La3+、乙醇+2-APB、乙醇+GSK-7975A、乙醇+R02959、乙醇+shRNA STIM1干擾組、乙醇+shRNA Orai1、乙醇+shRNA STIM1+ shRNA Orai1干擾組。3.檢測(cè)SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的表達(dá)量：以上刺激結(jié)束后,分別提取各組的總RNA及總蛋白,通過(guò)qPCR及western blot分別檢測(cè)乙醇刺激后STIM1、Orai1的基因及蛋白的表達(dá)情況。4.檢測(cè)胞漿中游離鈣離子濃度的變化：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入SOCE阻斷劑及SOCE相關(guān)蛋白分子shRNA干擾后肝細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。5.檢測(cè)肝細(xì)胞的損傷情況：通過(guò)MTT法,及全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)加入SOCE阻斷劑及SOCE相關(guān)蛋白分子shRNA干擾后肝細(xì)胞的存活率及轉(zhuǎn)氨酶的變化。6.檢測(cè)體外各組細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞周期、線粒體膜勢(shì)能(mitochondrial membrane potential, MMP):收集體外實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞,采用Annexin-V/PI染色、碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色及羅丹明(Rhodamine123,Rh123),通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞周期及線粒體膜勢(shì)能的變化。7.檢測(cè)各組細(xì)胞的胞漿及線粒體中的細(xì)胞色素C的含量及各凋亡蛋白的表達(dá)情況：分別收集肝細(xì)胞的胞漿及線粒體部分,檢測(cè)胞漿及線粒體中細(xì)胞色素C的含量,并通過(guò)western blot檢測(cè)SOCE相關(guān)蛋白分子及各凋亡蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：1.針對(duì)STIM1、Orai1有效的shRNA的篩選：設(shè)計(jì)合成針對(duì)STIM1、Orai1的shRNA,通過(guò)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)shRNA可明顯的抑制STIM1、Orai1的蛋白表達(dá)量。2.乙醇對(duì)SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1表達(dá)的影響：與PBS組相比,100mM乙醇明顯增加了STIM1、Orai1的基因及蛋白的表達(dá)量,并且影響持續(xù)達(dá)72小時(shí)。3. SOCE阻斷劑及shRNA干擾后對(duì)胞漿中游離鈣離子濃度的影響：科羅索酸、La3+、2-APB、GSK-7975A、RO2959、shRNA STIM1、shRNA Orai1、shRNA STIM1+shRNA Orai1均可明顯降低乙醇誘導(dǎo)的胞漿中升高的鈣離子濃度,且各阻斷劑之間無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。4. SOCE阻斷劑及shRNA干擾后對(duì)肝細(xì)胞損傷的影響：科羅索酸、La3+、2-APB、 GSK-7975A、RO2959、shRNA STIM1、shRNA Orai1、shRNA STIM1+shRNA Orai1均可明顯升高乙醇降低的細(xì)胞存活率,降低乙醇升高的轉(zhuǎn)氨酶,且各個(gè)阻斷劑之間無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別。5.各組刺激對(duì)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期及線粒體膜勢(shì)能的影響：與正常對(duì)照組相比,100mM乙醇刺激可明顯升高肝細(xì)胞的凋亡率；增加S期的細(xì)胞數(shù)量,降低G2/M期的細(xì)胞數(shù)量,表明S期阻滯增加；降低了Rh123的熒光濃度,即降低了線粒體膜勢(shì)能；與乙醇刺激組相比,各阻斷劑及shRNA干擾可降低肝細(xì)胞的凋亡率,減輕S期阻滯,升高線粒體膜勢(shì)能。6.各組刺激對(duì)細(xì)胞色素C的影響：與乙醇刺激組相比,阻斷SOCE后胞漿中細(xì)胞色素C含量相對(duì)減少,而線粒體中細(xì)胞色素C的含量相對(duì)增加,說(shuō)明阻斷SOCE可明顯減少線粒體中的細(xì)胞色素C釋放入胞漿。7.體外阻斷SOCE對(duì)于STIM1、Orai1及各凋亡蛋白表達(dá)的影響：與乙醇刺激組相比,阻斷SOCE可降低SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的蛋白量的表達(dá),同時(shí)降低了乙醇刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,減少了caspase3的激活。結(jié)論：1.乙醇可明顯的增高SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的基因及蛋白表達(dá),且影響可持續(xù)72小時(shí),說(shuō)明SOCE可能參與乙醇誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞的損傷。2.與乙醇刺激組相比,SOCE阻斷劑及shRNA干擾后,可明顯的降低胞漿中游離鈣離子的濃度,升高細(xì)胞存活率,并降低轉(zhuǎn)氨酶的水平,且各阻斷劑之間沒(méi)有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差別,進(jìn)一步說(shuō)明了SOCE可能在乙醇導(dǎo)致的BRL細(xì)胞的損傷中發(fā)揮作用。3.乙醇刺激可明顯增加BRL細(xì)胞的凋亡率及S期阻滯,而阻斷SOCE可明顯減輕BRL細(xì)胞的凋亡及S期阻滯,表明阻斷SOCE可能通過(guò)抑制凋亡減輕乙醇導(dǎo)致的BRL細(xì)胞的損傷。4.乙醇刺激可降低BRL細(xì)胞的線粒體膜勢(shì)能,促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體進(jìn)入胞漿,升高Bax/Bcl-2的比值,激活caspase3。而阻斷SOCE可明顯減輕上述過(guò)程,進(jìn)一步說(shuō)明在酒精性肝病中SOCE可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而導(dǎo)致BRL細(xì)胞的損傷。第三部分：SOCE在酒精誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷中的作用目的：通過(guò)觀察酒精灌胃組大鼠SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的表達(dá)及定位情況,并且給予SOCE阻斷劑科羅索酸后,觀察大鼠肝臟組織損傷情況,檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶的變化。同時(shí)檢測(cè)體內(nèi)肝臟組織胞漿中及線粒體中細(xì)胞色素C的變化,通過(guò)western blot檢測(cè)各凋亡蛋白的變化,進(jìn)一步分析SOCE在酒精導(dǎo)致的大鼠肝臟組織損傷中的作用機(jī)制。方法：1.體內(nèi)試驗(yàn)的分組：將40只成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠分為正常對(duì)照組,酒精性肝病模型組,酒精+科羅索酸治療1組(治療4周),酒精+科羅索酸治療2組(治療8周)。酒精性肝病模型組：將60%的北京紅星二鍋頭用水稀釋,用4.5、6.5、9g/Kg/天分別灌胃1-4周、5-8周、9-12周,一天劑量分兩次灌胃。正常組給予等量的生理鹽水灌胃,一天兩次�？屏_索酸1組：開(kāi)始于第八周,酒精灌胃之前10分鐘給予4mL 20%的科羅索酸灌胃,共治療4周。科羅索酸2組：灌胃方法同1組,開(kāi)始于第四周,共治療8周。大鼠在實(shí)驗(yàn)前后稱重,留取血樣,并將肝臟組織放入液氮或甲醛中備用。2.檢測(cè)酒精灌胃后SOCE相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況及定位：通過(guò)western blot和免疫組化檢測(cè)酒精灌胃后STIM1、Orai1蛋白的表達(dá)及定位情況。3.檢測(cè)各組肝臟組織的損傷情況：通過(guò)HE染色觀察酒精灌胃后及科羅索酸治療后肝臟組織的病理變化,并通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平。4.檢測(cè)體內(nèi)各組的胞漿及線粒體中的細(xì)胞色素C的含量：分別收集各組肝臟組織的胞漿及線粒體部分,檢測(cè)胞漿及線粒體中細(xì)胞色素C的含量。5.檢測(cè)體內(nèi)各組凋亡蛋白的表達(dá)情況：分別提取各組肝臟組織的蛋白,通過(guò)western blot檢測(cè)SOCE相關(guān)蛋白分子及各凋亡蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：1.酒精灌胃對(duì)于肝臟組織損傷的影響：酒精灌胃組大鼠體重上升較對(duì)照組減慢,HE染色發(fā)現(xiàn)酒精灌胃組大鼠肝臟損傷嚴(yán)重,肝細(xì)胞脂肪變,炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞壞死較對(duì)照組明顯增多。血清中ALT、AST較對(duì)照組明顯升高,且AST/ALT的比值明顯大于1。2.酒精灌胃對(duì)于SOCE相關(guān)蛋白分子表達(dá)的影響：與生理鹽水灌胃組相比,酒精灌胃明顯增加了SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的表達(dá)。3.科羅索酸對(duì)于肝臟組織損傷的影響：與酒精灌胃組相比,科羅索酸組的大鼠肝臟組織的損傷(肝細(xì)胞脂肪變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞壞死)明顯減輕；血清中的轉(zhuǎn)氨酶水平也明顯降低。4.體內(nèi)阻斷SOCE對(duì)細(xì)胞色素C的影響：與酒精灌胃組相比,給予科羅索酸后胞漿中細(xì)胞色素C的含量明顯減少,而線粒體中細(xì)胞色素C的含量相對(duì)增加,說(shuō)明阻斷SOCE可明顯減少線粒體中的細(xì)胞色素C的釋放。5.體內(nèi)阻斷SOCE對(duì)于STIM1、Orai1及各凋亡蛋白表達(dá)的影響：與酒精灌胃組相比,科羅索酸在降低SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1蛋白表達(dá)的同時(shí),也降低了酒精刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,減少了caspase3的激活。結(jié)論：1.酒精灌胃組中SOCE相關(guān)蛋白分子STIM1、Orai1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加,給予科羅索酸后STIM1、Orai1的表達(dá)減少,肝臟組織損傷明顯減輕,轉(zhuǎn)氨酶明顯下降,說(shuō)明SOCE可能參與酒精導(dǎo)致的SD大鼠肝臟組織的損傷。2.酒精灌胃組大鼠肝臟中細(xì)胞色素C釋放增加,Bax/Bcl-2的比值增高,caspase3激活增加。而科羅索酸可明顯減輕上述過(guò)程,進(jìn)一步說(shuō)明在酒精性肝病中SOCE可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而導(dǎo)致肝臟組織的損傷。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
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本文編號(hào)：1723786