本文選題：炎癥性腸病　切入點(diǎn)：腸壁纖維化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括克羅恩病(Crohn's disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC),是一種病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚的非特異性腸道疾病,具有慢性及反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。腸纖維化是IBD較嚴(yán)重的并發(fā)癥,被認(rèn)為是腸道組織對(duì)于慢性炎癥和損傷過度的、不可逆的傷口愈合反應(yīng)。有數(shù)據(jù)表明,40%以上的CD有程度不等的腸梗阻,約80%的患者最終需要手術(shù)治療。可見,腸纖維化已成為臨床IBD治療中面臨的重要問題。CD4~+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中最重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,在調(diào)控體內(nèi)免疫應(yīng)答和維持免疫平衡穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。其輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th)又包含Th1、Th2及Th17三種細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等促炎介質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng);而Th17細(xì)胞主要分泌IL-17和IL-6等細(xì)胞因子。目前傾向于Th1和Th17細(xì)胞主要參與CD發(fā)生。腸纖維化的發(fā)生是一種復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的病理生理過程,目前認(rèn)為是在易感基因基礎(chǔ)上,出現(xiàn)腸黏膜免疫失調(diào),與腸菌抗原相互作用,產(chǎn)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),釋放的炎癥因子和生長(zhǎng)因子等激活腸道間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生膠原等細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分沉積于腸壁所致[1]。在腸道纖維化過程中主要的效應(yīng)細(xì)胞是腸道成纖維細(xì)胞(intestinal fibroblasts,IFBs),當(dāng)該細(xì)胞增殖及活化增強(qiáng)時(shí),其增殖與活化的標(biāo)志物Vimentin和α-SMA表達(dá)上調(diào)。IFBs的合成與分泌ECM的功能增強(qiáng),一般情況下,成纖維細(xì)胞不表達(dá)α-SMA蛋白,但在各種因素如細(xì)胞因子和炎癥因子等的刺激下將發(fā)生活化,其α-SMA與膠原合成的功能均增強(qiáng)。TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于腸成纖維細(xì)胞活化以及其所產(chǎn)生的效應(yīng)改變發(fā)揮著不可忽視的作用。研究顯示,腸道炎癥發(fā)生過程中I型膠原、III型膠原沉積和TGF-β1表達(dá)增加的同時(shí),磷酸化Smad3表達(dá)也增加。腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A,TL1A)在炎癥組織巨噬細(xì)胞、黏膜固有層T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC中均有表達(dá)。TL1A作為TNF的唯一配體,可通過與其受體腫瘤壞死因子受體超家族成員死亡受體3(death receptor 3,DR3)結(jié)合,為T淋巴細(xì)胞的激活提供協(xié)同刺激信號(hào),促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的極化及效應(yīng)功能,在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。TL1A可通過與IL-12/IL-18結(jié)合而增強(qiáng)IFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá),其持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)黏膜的炎性反應(yīng)和腸壁纖維化的發(fā)生、誘導(dǎo)纖維性狹窄的發(fā)生。TL1A不僅可單獨(dú)或協(xié)同IL-12和IL-23作用于Th1細(xì)胞分泌IFN-γ,同時(shí)還可作用于Th17細(xì)胞使其分泌IL-17增加。TL1A是IBD的易感基因之一,TL1A及其受體可通過影響腸黏膜T細(xì)胞的活化、增殖,誘導(dǎo)Th細(xì)胞極化,從而致腸黏膜免疫系統(tǒng)耐受機(jī)制紊亂,由此引發(fā)腸道炎癥反應(yīng),從而參與IBD的發(fā)生。而慢性炎癥反應(yīng)是腸纖維化發(fā)生的首發(fā)因素,炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步激活腸成纖維細(xì)胞的活化,產(chǎn)生大量ECM,以致腸纖維化的形成。目的:探討淋巴細(xì)胞高表達(dá)TL1A在DSS誘導(dǎo)的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化中的作用,旨在為臨床IBD及腸纖維化的治療提供理論依據(jù)。方法:1 LCK-CD2-TL1A-GFP基因型的小鼠采用real-time Q-PCR的方法進(jìn)行篩選與鑒定。2右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)建立小鼠腸纖維化的模型,將轉(zhuǎn)基因型小鼠與C57BL/6野生型小鼠(體重20~25g,8~12周)分別隨機(jī)分為Control、DSS組,每組6只小鼠。Control組給予飲用蒸餾水,DSS組給予間斷飲用2%DSS水,共四周。飲用DSS的時(shí)間段為:第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天,第27、28天及其余時(shí)間飲用蒸餾水。3每日觀察小鼠的食欲、體重、糞便性狀、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、大便隱血(聯(lián)苯胺法測(cè)定)及便血情況等,參照Cooper HS評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分,評(píng)估腸黏膜的炎癥程度。4觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)的變化,測(cè)量結(jié)腸的長(zhǎng)度,計(jì)算結(jié)腸形態(tài)學(xué)評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分以及測(cè)定結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量,評(píng)估結(jié)腸炎癥程度。5免疫熒光技術(shù),檢測(cè)CD4~+T淋巴細(xì)胞、IFN-γ、IL-17在小鼠腸組織中的定位表達(dá),評(píng)估在慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)量的變化。6提取脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中(mesenteric lymph nodes,MLN)的單個(gè)核細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)量,探討在慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)量的變化。7酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測(cè)IFN-γ、IL-17,評(píng)估在慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化過程中組織細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。8 Masson染色與天狼猩紅染色方法,檢測(cè)結(jié)腸組織中膠原纖維的厚度,評(píng)估結(jié)腸纖維化的程度。9免疫組織化學(xué)檢測(cè)I型膠原、III型膠原、Vimentin、α-smooth muscle actin(α-SMA)、以及TGF-β1/Smad3在小鼠結(jié)腸組織中的的表達(dá)。結(jié)果1根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP的序列,測(cè)定小鼠的DNA,在192bp的位置是轉(zhuǎn)基因小鼠的目的基因測(cè)定成像,而野生型小鼠基因測(cè)定成像,沒有檢測(cè)到該目的基因,根據(jù)此結(jié)果篩選并鑒定轉(zhuǎn)基因的小鼠.2與Control組小鼠相比,野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠DSS組的體重逐漸減輕,DAI評(píng)分逐漸升高,結(jié)腸壁明顯充血水腫,結(jié)腸長(zhǎng)度縮短;結(jié)腸組織病理結(jié)果顯示:可見淺潰瘍形成,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),病理評(píng)分升高(WT小鼠:11.75±0.50 vs 00.00±0.00,P0.05;Tg小鼠:14.00±1.05 vs 0.00±0.00,P0.05);MPO活性明顯升高(P0.05)。DSS組小鼠中,與WT小鼠相比較,Tg小鼠的DSS組結(jié)腸炎癥程度增加(P0.05).3免疫熒光檢測(cè)IL-17、IFN-γ表達(dá)情況,DSS組小鼠中Tg小鼠與WT小鼠相比較,Tg小鼠IL-17的平均光密度顯著升高(126.426 U/g±15.939U/g vs 84.528 U/g±11.967 U/g,P0.05)。DSS組小鼠中,與WT小鼠相比較,Tg小鼠IFN-γ的平均光密度顯著升高(115.428 U/g±13.933 U/g vs81.978 U/g±11.967 U/g,P0.05)。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MLN、脾臟單個(gè)核淋巴細(xì)胞中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)量,在DSS組中,Tg小鼠與WT小鼠相比較,MLN單個(gè)核淋巴細(xì)胞中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)的百分比明顯升高(CD4~+IFN-γ+:8.04%±0.44%vs 6.71%±0.26%,P0.05;CD4~+IL-17+:5.61%±0.19%vs 2.47%±0.28%,P0.05);在DSS組中,Tg小鼠與WT小鼠相比較,脾臟單個(gè)核淋巴細(xì)胞中的CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+細(xì)胞數(shù)的百分比明顯升高(CD4~+IFN-γ+:10.45%±0.66%vs 7.29%±0.58%,P0.05;CD4~+IL-17+:3.33%±0.33%vs 2.10%±0.36%,P0.05)。5 ELISA檢測(cè)脾臟、LPMC、MLN的單個(gè)核細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-17的水平,結(jié)果顯示:與Control組相比,DSS組中WT與Tg小鼠小鼠脾臟、LPMC、MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平升高,WT小鼠(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,277.484±9.211 pg/m L vs56.994±4.960 pg/m L,P0.05;LPMC分泌的IL-17水平:31.628±1.055pg/m L vs 30.800±5.714 pg/m L,P0.05);Tg小鼠(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,382.315±152.343 pg/m L vs 120.444±35.144 pg/m L,P0.05;LPMC分泌的IL-17水平:36.143±8.630 pg/m L vs 35.744±1.446 pg/m L,P0.05);DSS組中Tg小鼠與WT小鼠相比,脾臟、LPMC、MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平明顯升高(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,382.315±152.343 pg/m L vs 1,277.484±9.211 pg/m L,P0.05;LPMC分泌的IL-17水平:36.143±8.630 pg/m L vs 31.628±1.055 pg/m L,P0.05)。6 Masson染色與天狼猩紅染色觀察膠原纖維染色程度,在DSS組中,與WT小鼠相比,Tg小鼠的Masson染色與天狼猩紅染色腸纖維化程度明顯加重(0.47±0.05 vs 0.36±0.016,P0.05;0.40±0.01 vs 0.32±0.015,P0.05)。7在DSS組中,與WT小鼠相比,Tg小鼠免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Vimentin(0.80±0.02 vs 0.65±0.05,P0.05)、α-smooth muscle actin(α-SMA)(0.60±0.04 vs 0.39±0.04,P0.05)、I型膠原(0.67±0.08 vs 0.39±0.01,P0.05)、III型膠原(0.83±0.04 vs 0.49±0.03,P0.05)、以及TGF-β1(0.73±0.04 vs0.55±0.04,P0.05)/Smad3(0.83±0.04 vs 0.59±0.02,P0.05)表達(dá)均增加。結(jié)論:1 TL1A通過上調(diào)IFN-γ和IL-17的表達(dá),促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥及腸纖維化的發(fā)生發(fā)展;2 TL1A促進(jìn)腸成纖維細(xì)胞的增殖與活化,促進(jìn)I型與III型膠原合成,從而加重慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸纖維化程度;3上調(diào)TGF-β1與Smad3的表達(dá)是TL1A促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸纖維化的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 李輝;TL1A在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化發(fā)生中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

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1 宋佳;TL1A對(duì)人結(jié)腸成纖維細(xì)胞膠原代謝的影響和機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1652038