本文關(guān)鍵詞：EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的表達(dá)變化

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【摘要】：肝臟作為機(jī)體內(nèi)最大的腺體,不僅參與了糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝,還具有排泄、分泌、生物轉(zhuǎn)化等重要功能。因此,當(dāng)肝臟功能出現(xiàn)損傷時(shí),不僅機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝會(huì)發(fā)生紊亂,其他重要器官的功能也會(huì)出現(xiàn)障礙。臨床上的肝臟手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除術(shù)等的實(shí)施過(guò)程中均需要暫時(shí)性阻斷肝臟的血液供應(yīng),但當(dāng)其血液供應(yīng)被重新恢復(fù)時(shí)即會(huì)發(fā)生肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)。因此,HIRI已成為臨床肝臟外科治療過(guò)程中的主要并發(fā)癥。它的發(fā)生也是引發(fā)肝臟手術(shù)患者出現(xiàn)手術(shù)失敗、肝功能衰竭,以及術(shù)后愈后較差的主要原因。實(shí)驗(yàn)研究表明,肝臟被阻斷的血供被重新恢復(fù)時(shí)即會(huì)有大量活性氧族(reactive oxygen species:ROS)的產(chǎn)生,高活性分子ROS對(duì)肝臟組織細(xì)胞引發(fā)的過(guò)氧化損害是導(dǎo)致HIRI發(fā)生的主要機(jī)制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-.),過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH.)等。ROS能與細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)、酶、核酸、細(xì)胞骨架及脂質(zhì)物質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致線粒體功能障礙和胞膜結(jié)構(gòu)受損,甚至組織和細(xì)胞的死亡。肺臟是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧氣供應(yīng)量和缺氧狀態(tài)非常敏感的臟器。在缺血再灌注氧氣供應(yīng)量發(fā)生變化時(shí),肺臟是否也會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),遭受過(guò)氧化損傷?超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一,它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此,SOD是清除O2-的重要酶蛋白,在機(jī)體內(nèi)的抗過(guò)氧化過(guò)程具有重要作用。哺乳動(dòng)物體內(nèi)共有三中SOD亞型:在線粒體內(nèi)以錳作為輔基的錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),在細(xì)胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是機(jī)體內(nèi)唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型,它依靠自身的肝素結(jié)合域(heparin-binding domain,HBD)能與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面結(jié)合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):細(xì)胞外的EC-SOD在機(jī)體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)中可能發(fā)揮了更重要的作用。HIRI可引起其他臟器的損傷,包括遠(yuǎn)隔臟器心、腦、肺等。這些遠(yuǎn)隔臟器的損傷與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等密切相關(guān)。EC-SOD在肺臟組織內(nèi)大量表達(dá),在HIRI發(fā)生后,肺組織遭受損傷時(shí),肺組織內(nèi)的抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表達(dá)如何變化,在缺血再灌注后是否發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用,有待研究。本研究通過(guò)阻斷大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復(fù)其灌注的方法制造大鼠HIRI模型,然后測(cè)定大鼠肺組織內(nèi)的MDA和H2O2水平變化,以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)改變。探討HIRI發(fā)生后肺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD在此過(guò)程中的抗氧化應(yīng)激作用。目的:觀察大鼠HIRI模型肺組織內(nèi)的MDA水平、H2O2水平以及抗氧化酶EC-SOD的基因和蛋白表達(dá)水平變化,探討HIRI發(fā)生后肺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD在此過(guò)程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1大鼠HIRI模型的制備及標(biāo)本處理選用體重190-210g健康雄性Wistar大鼠12只,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。將大鼠隨機(jī)分為HIRI組(6只),Conrol組(6只)。采用自配的6%水合氯醛(0.5ml/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。按照Kohli等人的實(shí)驗(yàn)方法,用自制的手術(shù)玻璃針小心分離膽管和肝血管,分離出通往肝左葉和肝中葉的血管以及膽管蒂,并采用無(wú)損傷血管夾夾閉。夾閉30分鐘后撤去血管夾,重新恢復(fù)肝中葉和肝左葉的血液灌注,制造70%的肝實(shí)質(zhì)HIRI模型。Conrol組大鼠被麻醉后,只分離通往肝中葉和肝左葉的血管及膽管蒂,30分鐘后關(guān)閉大鼠腹腔�；謴�(fù)肝臟血液供應(yīng)6小時(shí)后再次重新將其麻醉,首先收集大鼠血液,用于血清ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)和MDA含量檢測(cè);取大鼠肝臟和肺臟,將肝臟置于4%多聚甲醛溶液中固定,采用HE染色法觀察大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;將大鼠肺臟置于液氮中,用于抗氧化酶EC-SOD的基因水平和蛋白水平檢測(cè),以及肺組織內(nèi)MDA含量和H2O2含量檢測(cè)。2測(cè)定指標(biāo)及檢測(cè)方法2.1 HE染色觀察大鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變肝組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋處理后,進(jìn)行切片,切片厚度約5μm,采用蘇木精伊紅進(jìn)行染色,Olympus光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。2.2大鼠血清ALT活性檢測(cè)收集的大鼠血液未進(jìn)行抗凝處理,靜置30分鐘后,3000rpm離心10min,收集血清,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT活性。2.3大鼠血清MDA含量檢測(cè)大鼠血清內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。2.4大鼠肺組織勻漿制備以及MDA含量檢測(cè)從-80℃冰箱中取出HIRI組和Control組大鼠肺組織,按照10mg/100μl的處理比例,加入4℃勻漿緩沖液(PH7.4,磷酸鉀緩沖液50mmol/L,PMSF1mmol/L,鹽酸苯甲脒1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,β-巰基乙醇5mmol/L,EDTANa31mmol/L),冰浴下進(jìn)行勻漿處理,勻漿液于4℃,4000rpm離心20分鐘,收集上清即制成10%肺組織勻漿,勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。2.5大鼠肺組織H2O2含量檢測(cè)將從-80℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl比例加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴下進(jìn)行勻漿處理,勻漿液于4℃,4000rpm離心20分鐘,收集上清即制成10%肺組織勻漿。肺組織勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法進(jìn)行檢測(cè),以每克樣本蛋白所含H2O2量(mmol/g pro)表示肺組織H2O2含量。2.6大鼠肺組織EC-SOD mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用TRIzol試劑提取大鼠肺組織總RNA,并反轉(zhuǎn)錄生成c DNA。GAPDH作為內(nèi)參照,RT-PCR法測(cè)定EC-SOD mRNA表達(dá)水平。EC-SOD擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值與內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值之比,表示目的基因EC-SOD的相對(duì)表達(dá)水平。2.7大鼠肺組織EC-SOD蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用免疫印跡法測(cè)定大鼠肺組織EC-SOD的蛋白表達(dá)水平。將-80度冷凍的大鼠肺組織制成勻漿液,離心后取上清,并做蛋白變性處理。蛋白總量采用改良Lorry法進(jìn)行測(cè)定。電泳蛋白上樣量為62ug。經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室溫靜置過(guò)夜。經(jīng)過(guò)洗膜處理后,加入抗兔IgG二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)。按發(fā)光試劑操作指導(dǎo)先后進(jìn)行顯影、定影、晾干處理。掃描膠片并進(jìn)行圖像分析,EC-SOD灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果:1大鼠肝臟組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下,對(duì)照組大鼠肝組織切片顯示:肝細(xì)胞排列整齊形成條索狀,圍繞在中央靜脈周?chē)煞派錉钆帕?肝血竇大小均勻未見(jiàn)擴(kuò)張充血。肝缺血再灌注損傷組大鼠肝組織切片顯示:肝細(xì)胞有受壓萎縮現(xiàn)象,并且淤血嚴(yán)重,肝血竇擴(kuò)張充血比較明顯,肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn),HE染色變淺,可見(jiàn)部分肝細(xì)胞水腫,體積有所增大。2大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性改變對(duì)照組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為20.03±5.23U/L,而肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為87.43±9.06 U/L。肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯高于對(duì)照組(P0.01)。3大鼠血清中丙二醛含量變化對(duì)照組大鼠血清中丙二醛的含量為12.69±2.29 umol/L,肝缺血再灌注損傷組大鼠血清中丙二醛的含量為17.54±1.96 umol/L。肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙二醛含量明顯高于對(duì)照組(P0.01)。4大鼠肺勻漿內(nèi)丙二醛含量變化HIRI組大鼠肺內(nèi)丙二醛含量(14.09±2.47 mmol/g)明顯高于對(duì)照組大鼠肺內(nèi)丙二醛含量(9.81±1.89mmol/g,P0.01)5肺勻漿內(nèi)H2O2含量變化HIRI組大鼠肺內(nèi)H2O2含量(19.52±3.03 mmol/g)明顯高于Con組大鼠肺內(nèi)H2O2含量(13.39±1.97mmol/g)(P0.01)。6肺組織內(nèi)EC-SOD mRNA表達(dá)量的變化以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照,采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠肺組織內(nèi)抗氧化酶EC-SOD mRNA表達(dá)量的改變。HIRI組大鼠肺組織內(nèi)的EC-SOD mRNA水平(0.91±0.13)明顯高于Con組(0.49±0.08)(P0.01)。此結(jié)果說(shuō)明HIRI組大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD表達(dá)明顯升高。7大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平大鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞外-超氧化物歧化酶(EC-SOD)的蛋白相對(duì)表達(dá)量,采用Western blotting方法測(cè)定。將其內(nèi)參照GAPDH的比值作為其相對(duì)表達(dá)量,然后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)表明:對(duì)照組大鼠肺組織中EC-SOD的蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.71±0.12)明顯低于肝缺血再灌注損傷組的相對(duì)表達(dá)量(1.09±0.18)(P0.01),也表明大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論:1大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肺組織中MDA和H2O2含量均明顯增加。提示:在肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí),肺組織也遭受了過(guò)氧化損傷。2肺組織內(nèi)EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝臟缺血再灌注誘發(fā)肺組織遭受過(guò)氧化損傷時(shí)明顯增強(qiáng)。提示:抗氧化酶EC-SOD在此過(guò)程中可能參與了抗氧化應(yīng)激反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R575

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