本文關鍵詞：日本血吸蟲重組蛋白Cystatin保護小鼠結腸炎及其免疫調節(jié)機制研究

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【摘要】：背景：炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性且易復發(fā)的腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn's disease, CD),具體發(fā)病因素尚不明確。目前認為IBD是由綜合性因素導致,包括環(huán)境因素,免疫紊亂,腸道粘膜屏障功能破壞以及腸腔內菌群失調等,這些因素觸發(fā)了先天免疫細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞介導的免疫應答,產(chǎn)生一氧化氮(NO),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子和介質,進一步啟動適應性免疫應答,產(chǎn)生大量前炎癥因子IL-17A、IFNγ等,最終導致腸道的強烈炎癥反應。近年來由于發(fā)達國家衛(wèi)生條件不斷改善已接近高度清潔水平,很多寄生于腸道的蠕蟲被徹底清除,但自身免疫性疾病的發(fā)生率卻逐年增加,這種趨勢也逐漸蔓延至發(fā)展中國家及欠發(fā)達地區(qū)。這一現(xiàn)象可以用“衛(wèi)生假說”理論很好解釋,基于這一理論,許多學者研究發(fā)現(xiàn)預先感染蠕蟲或采用蠕蟲來源的某些具有免疫調節(jié)作用的蛋白干預炎癥性腸病小鼠模型,發(fā)現(xiàn)具有抑制小鼠腸道炎癥的作用。有研究表明預先感染Heligmosomoides polygyrus對2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎小鼠具有肯定的保護作用；預先感染Trichinella spiralis或是用幼蟲抗原治療DNBS誘導的腸炎發(fā)現(xiàn)也是同樣有保護作用。另有學者研究發(fā)現(xiàn)予曼氏血吸蟲的蟲卵或可溶性蛋白干預結腸炎小鼠,通過降低前炎癥因子IFNγ、IL-17A的mRNA表達,促進抗炎因子IL-4mRNA的表達從而減輕小鼠結腸炎。但是若予以活蟲或蟲卵給予患者口服,會存在較大風險,一般不易被患者接受,因此研究者們將目光轉向了蠕蟲來源的相關蛋白,蟲體的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)就是其中一種被證實具有調節(jié)宿主免疫功能的蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制劑,簡稱胱抑素,是一類廣泛存在于生物體內的包括存在于各種蠕蟲體內的半胱氨酸蛋白酶高效抑制劑,構成一個半胱氨酸酶抑制劑的大家族,依據(jù)氨基酸序列被分為3大家族,即stefins(家族1),cystatins(家族2)和kininogens(家族3)。屬于家族1(stefins)的日本血吸蟲cystatin基因組DNA和cDNA的全長序列在基因庫里分別編號為FJ617451和FJ617450, cDNA的全長基因序列的開放閱讀框長度為306bp,編碼101個氨基酸,理論分子量為11.3kDa。屬于家族2的日本血吸蟲的cystatin近年已被體外實驗證實通過抑制活化的RAW264.7的LPS誘導產(chǎn)生的TNF-α和IL-6對巨噬細胞的偏移有調節(jié)作用。對于日本血吸蟲和曼氏血吸蟲感染宿主誘導的負向免疫調控研究已深入到蟲源性分子的水平,但是日本血吸蟲半胱氨酸酶抑制劑相關的體內實驗尚未見報道。因此設計本課題擬觀察rSjcysatin對TNBS誘導的結腸炎小鼠的保護作用及探索負向免疫調節(jié)機制。目的：觀察日本血吸蟲的cystatin(家族1)對TNBS誘導的小鼠結腸炎的保護作用。通過分析比較各組小鼠結腸炎的炎癥指標的變化,以及小鼠脾臟、腸系膜淋巴結、結腸固有層單個核細胞的CD4+T淋巴細胞的Th1、Th2、Th17、Treg的比例變化來探討日本血吸蟲cystatin對結腸炎小鼠的保護作用,并探索rSjcystatin負向免疫調節(jié)機制,為治療IBD提供一個可靠的理論依據(jù),從而避免臨床上運用感染蠕蟲來調節(jié)患者免疫失衡治療IBD。方法：將pET-28A-Sj cystatin質粒轉化到大腸桿菌BL21,37 ℃, 1mM IPTG誘導表達重組蛋白后經(jīng)超聲破菌、鎳柱純化,BCA法測定純化蛋白質濃度-80℃保存或直接稀釋后注射小鼠。60只8周雌性Balb/C小鼠隨機分為6組,每組10只,分別為：①rSjcystatin治療組：造模后6 h和24 h腹腔注射rSjcystatin 50 μg; ② rSjcystatin提前干預組：造模前腹腔注射rSjcystatin50 μg共3次,每次間隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以TNBS灌腸造模；③結腸炎模型組：TNBS灌腸造模；④ rSjcystatin提前干預對照組：造模前腹腔注射rSjcystatin50μg共3次,每次間隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以PBS灌腸；⑤ rSjcystatin治療對照組：PBS灌腸后6 h和24h腹腔注射rSjcystatin 50 μg;⑥正常對照組：PBS對照組。所有試驗動物造模3天后無痛處死,結腸病變進行炎癥評分5方面包括疾病癥狀評分(DAI)、結腸長度變化、結腸病變程度(MAO)、病理分級(MIO)、結腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定,并提取脾、腸系膜淋巴結及結腸粘膜固有層淋巴細胞,流式檢測Thl(IFN-γ) Th2(IL-4)、 Th17(IL-17A)及Treg比例；qRT-PCR則定上述細胞因子的mRNA表達,ELISA測定結腸組織勻漿上清中相關因子的水平,Western blot測定結腸勻漿中Th1 (T-bet)、Th2 (GATA-3)、Th17 (RORyt)及Treg (Foxp3)重要轉錄因子的蛋白表達。結果：(1)TNBS結腸炎模型小鼠第1天出現(xiàn)程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有顯著的體重下降；rSjcystatin治療組小鼠DAI、MAO、MIO、MPO均明顯低于結腸炎小鼠；而rSjcystatin預防組小鼠結腸炎癥指標與結腸炎組小鼠相比無差異(p＞0.05)；(2)實驗小鼠病變局部和脾臟細胞因子變化：①脾臟淋巴細胞：TNBS誘導結腸炎組小鼠脾臟CD4+IFNγ+、CD4+IL-17A+占CD4+T比例分別為(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,與正常小鼠CD4+IFNγ+(1.28±0.29)%、CD4+IL-17A+(0.90±0.09)%相比顯著增加(p0.05); rSjcystatin治療組小鼠的脾淋巴細胞CD4+IFNγ+比例下降為(1.55+0.20)%,與炎癥組小鼠相比,有統(tǒng)計學意義；CD4+IL-17A+比例為(1.75±0.49)%,IL-17A mRNA表達水平(2.70±1.35)較炎癥組小鼠(3.63+1.80)減少,但無統(tǒng)計學差異；各組間脾臟淋巴細胞Treg、CD4+IL-4+占CD4+T比例、Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA表達水平均無統(tǒng)計學差異； ②腸系膜淋巴結(MLN):rSjcystatin治療組小鼠MLN中CD4+IFNy+比例為(3.11±0.51)%,與結腸炎組小鼠(4.61±1.02)%相比明顯降低(p0.05)；MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明顯高于炎癥組(4.39±1.38)%和正常組小鼠(1.28±0.29)%; Foxp3. IL-10和TGF-p mRNA表達增加(球0.05)：③結腸固有層淋巴細胞(LPMC):rSjcystatin治療組小鼠CD4+IFNy+占CD4+T比例(2.94±1.04)%與炎癥組CD4+IFNy+比例(8.23±0.90)%相比明顯減少(p＜0.05)；rSjcystatin治療組CD4+CD25-Foxp3+T比例(5.25±1.51)%明顯高于炎癥組小鼠LPMC(1.78±0.41)% (p0.05);治療組小鼠MLN和LPMC的CD4+IL-4+與CD4+IL-17A+占CD4+T比例、IL-4mRNA和IL-17A mRNA與炎癥組小鼠相比無統(tǒng)計學差異；(3)結腸勻漿上清中各因子水平：rSjcystatin治療組小鼠結腸勻漿上清中IFNy (1126.8±230.16)pg/ml較炎癥組(1628.6±358.51)pg/ml明顯下降,IL-4(159.95±30.66) pg/ml, IL-13 (8623.1±1644.19) pg/ml, IL-10 (455.51±187.87) pg/ml, TGF-β (116.18±17.68) pg/ml均較炎癥組明顯上升；(4) Western blot檢測結腸相關轉錄因子表達：rSjcystatin治療組的Thl轉錄因子T-bet表達明顯低于炎癥組小鼠,而Th2轉錄因子GATA-3和Treg轉錄因子Foxp3表達明顯增加,但Th17轉錄因子RORyt在炎癥組和治療組小鼠表達無明顯差異。結論：TNBS誘導的結腸炎小鼠提前給予日本血吸蟲重組rSjcystatin未見顯著的預防作用：但是造模后給藥能顯著減輕TNBS誘導的小鼠結腸炎的病理損傷。其免疫調節(jié)機制可能是rSjcystatin下調了結腸炎小鼠的Thl優(yōu)勢應答,上調了腸系膜淋巴結和腸道調節(jié)性T細胞及腸道局部Th2反應。rSjcystatin具有減輕炎癥性腸病病理損傷和下調Th1應答的作用,對于其潛在的治療炎癥性腸病的價值尚待深入研究。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62

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