本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲重組蛋白Cystatin保護(hù)小鼠結(jié)腸炎及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究

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【摘要】：背景：炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性且易復(fù)發(fā)的腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)和克隆氏病(Crohn's disease, CD),具體發(fā)病因素尚不明確。目前認(rèn)為IBD是由綜合性因素導(dǎo)致,包括環(huán)境因素,免疫紊亂,腸道粘膜屏障功能破壞以及腸腔內(nèi)菌群失調(diào)等,這些因素觸發(fā)了先天免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生一氧化氮(NO),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子和介質(zhì),進(jìn)一步啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答,產(chǎn)生大量前炎癥因子IL-17A、IFNγ等,最終導(dǎo)致腸道的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。近年來由于發(fā)達(dá)國家衛(wèi)生條件不斷改善已接近高度清潔水平,很多寄生于腸道的蠕蟲被徹底清除,但自身免疫性疾病的發(fā)生率卻逐年增加,這種趨勢也逐漸蔓延至發(fā)展中國家及欠發(fā)達(dá)地區(qū)。這一現(xiàn)象可以用“衛(wèi)生假說”理論很好解釋,基于這一理論,許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先感染蠕蟲或采用蠕蟲來源的某些具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白干預(yù)炎癥性腸病小鼠模型,發(fā)現(xiàn)具有抑制小鼠腸道炎癥的作用。有研究表明預(yù)先感染Heligmosomoides polygyrus對2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠具有肯定的保護(hù)作用；預(yù)先感染Trichinella spiralis或是用幼蟲抗原治療DNBS誘導(dǎo)的腸炎發(fā)現(xiàn)也是同樣有保護(hù)作用。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)予曼氏血吸蟲的蟲卵或可溶性蛋白干預(yù)結(jié)腸炎小鼠,通過降低前炎癥因子IFNγ、IL-17A的mRNA表達(dá),促進(jìn)抗炎因子IL-4mRNA的表達(dá)從而減輕小鼠結(jié)腸炎。但是若予以活蟲或蟲卵給予患者口服,會存在較大風(fēng)險(xiǎn),一般不易被患者接受,因此研究者們將目光轉(zhuǎn)向了蠕蟲來源的相關(guān)蛋白,蟲體的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)就是其中一種被證實(shí)具有調(diào)節(jié)宿主免疫功能的蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制劑,簡稱胱抑素,是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的包括存在于各種蠕蟲體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶高效抑制劑,構(gòu)成一個(gè)半胱氨酸酶抑制劑的大家族,依據(jù)氨基酸序列被分為3大家族,即stefins(家族1),cystatins(家族2)和kininogens(家族3)。屬于家族1(stefins)的日本血吸蟲cystatin基因組DNA和cDNA的全長序列在基因庫里分別編號為FJ617451和FJ617450, cDNA的全長基因序列的開放閱讀框長度為306bp,編碼101個(gè)氨基酸,理論分子量為11.3kDa。屬于家族2的日本血吸蟲的cystatin近年已被體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過抑制活化的RAW264.7的LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6對巨噬細(xì)胞的偏移有調(diào)節(jié)作用。對于日本血吸蟲和曼氏血吸蟲感染宿主誘導(dǎo)的負(fù)向免疫調(diào)控研究已深入到蟲源性分子的水平,但是日本血吸蟲半胱氨酸酶抑制劑相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道。因此設(shè)計(jì)本課題擬觀察rSjcysatin對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用及探索負(fù)向免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。目的：觀察日本血吸蟲的cystatin(家族1)對TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用。通過分析比較各組小鼠結(jié)腸炎的炎癥指標(biāo)的變化,以及小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、結(jié)腸固有層單個(gè)核細(xì)胞的CD4+T淋巴細(xì)胞的Th1、Th2、Th17、Treg的比例變化來探討日本血吸蟲cystatin對結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用,并探索rSjcystatin負(fù)向免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,為治療IBD提供一個(gè)可靠的理論依據(jù),從而避免臨床上運(yùn)用感染蠕蟲來調(diào)節(jié)患者免疫失衡治療IBD。方法：將pET-28A-Sj cystatin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,37 ℃, 1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后經(jīng)超聲破菌、鎳柱純化,BCA法測定純化蛋白質(zhì)濃度-80℃保存或直接稀釋后注射小鼠。60只8周雌性Balb/C小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分別為：①rSjcystatin治療組：造模后6 h和24 h腹腔注射rSjcystatin 50 μg; ② rSjcystatin提前干預(yù)組：造模前腹腔注射rSjcystatin50 μg共3次,每次間隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以TNBS灌腸造模；③結(jié)腸炎模型組：TNBS灌腸造模；④ rSjcystatin提前干預(yù)對照組：造模前腹腔注射rSjcystatin50μg共3次,每次間隔5天,在最后一次注射蛋白的一周后予以PBS灌腸；⑤ rSjcystatin治療對照組：PBS灌腸后6 h和24h腹腔注射rSjcystatin 50 μg;⑥正常對照組：PBS對照組。所有試驗(yàn)動物造模3天后無痛處死,結(jié)腸病變進(jìn)行炎癥評分5方面包括疾病癥狀評分(DAI)、結(jié)腸長度變化、結(jié)腸病變程度(MAO)、病理分級(MIO)、結(jié)腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定,并提取脾、腸系膜淋巴結(jié)及結(jié)腸粘膜固有層淋巴細(xì)胞,流式檢測Thl(IFN-γ) Th2(IL-4)、 Th17(IL-17A)及Treg比例；qRT-PCR則定上述細(xì)胞因子的mRNA表達(dá),ELISA測定結(jié)腸組織勻漿上清中相關(guān)因子的水平,Western blot測定結(jié)腸勻漿中Th1 (T-bet)、Th2 (GATA-3)、Th17 (RORyt)及Treg (Foxp3)重要轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)。結(jié)果：(1)TNBS結(jié)腸炎模型小鼠第1天出現(xiàn)程度不同的稀便、黏液血便或血便,并伴有顯著的體重下降；rSjcystatin治療組小鼠DAI、MAO、MIO、MPO均明顯低于結(jié)腸炎小鼠；而rSjcystatin預(yù)防組小鼠結(jié)腸炎癥指標(biāo)與結(jié)腸炎組小鼠相比無差異(p＞0.05)；(2)實(shí)驗(yàn)小鼠病變局部和脾臟細(xì)胞因子變化：①脾臟淋巴細(xì)胞：TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組小鼠脾臟CD4+IFNγ+、CD4+IL-17A+占CD4+T比例分別為(2.92±0.54)%和(2.27±0.53)%,與正常小鼠CD4+IFNγ+(1.28±0.29)%、CD4+IL-17A+(0.90±0.09)%相比顯著增加(p0.05); rSjcystatin治療組小鼠的脾淋巴細(xì)胞CD4+IFNγ+比例下降為(1.55+0.20)%,與炎癥組小鼠相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD4+IL-17A+比例為(1.75±0.49)%,IL-17A mRNA表達(dá)水平(2.70±1.35)較炎癥組小鼠(3.63+1.80)減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各組間脾臟淋巴細(xì)胞Treg、CD4+IL-4+占CD4+T比例、Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； ②腸系膜淋巴結(jié)(MLN):rSjcystatin治療組小鼠MLN中CD4+IFNy+比例為(3.11±0.51)%,與結(jié)腸炎組小鼠(4.61±1.02)%相比明顯降低(p0.05)；MLN中Treg比例(9.82±0.85)%明顯高于炎癥組(4.39±1.38)%和正常組小鼠(1.28±0.29)%; Foxp3. IL-10和TGF-p mRNA表達(dá)增加(球0.05)：③結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞(LPMC):rSjcystatin治療組小鼠CD4+IFNy+占CD4+T比例(2.94±1.04)%與炎癥組CD4+IFNy+比例(8.23±0.90)%相比明顯減少(p＜0.05)；rSjcystatin治療組CD4+CD25-Foxp3+T比例(5.25±1.51)%明顯高于炎癥組小鼠LPMC(1.78±0.41)% (p0.05);治療組小鼠MLN和LPMC的CD4+IL-4+與CD4+IL-17A+占CD4+T比例、IL-4mRNA和IL-17A mRNA與炎癥組小鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；(3)結(jié)腸勻漿上清中各因子水平：rSjcystatin治療組小鼠結(jié)腸勻漿上清中IFNy (1126.8±230.16)pg/ml較炎癥組(1628.6±358.51)pg/ml明顯下降,IL-4(159.95±30.66) pg/ml, IL-13 (8623.1±1644.19) pg/ml, IL-10 (455.51±187.87) pg/ml, TGF-β (116.18±17.68) pg/ml均較炎癥組明顯上升；(4) Western blot檢測結(jié)腸相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)：rSjcystatin治療組的Thl轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)明顯低于炎癥組小鼠,而Th2轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)明顯增加,但Th17轉(zhuǎn)錄因子RORyt在炎癥組和治療組小鼠表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠提前給予日本血吸蟲重組rSjcystatin未見顯著的預(yù)防作用：但是造模后給藥能顯著減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的病理損傷。其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能是rSjcystatin下調(diào)了結(jié)腸炎小鼠的Thl優(yōu)勢應(yīng)答,上調(diào)了腸系膜淋巴結(jié)和腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及腸道局部Th2反應(yīng)。rSjcystatin具有減輕炎癥性腸病病理損傷和下調(diào)Th1應(yīng)答的作用,對于其潛在的治療炎癥性腸病的價(jià)值尚待深入研究。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62

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本文編號：1243586