本文關(guān)鍵詞：Nrf2在小鼠肝臟的脂肪代謝和膽汁淤積癥中的作用

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【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠在肝臟中調(diào)控一系列解毒及抗氧化防御基因的表達。它的激活能夠?qū)τH電體做出應(yīng)答,并通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合,介導(dǎo)目的基因的表達。Nrf2-ARE信號通路在肝臟疾病中的作用越來越受到關(guān)注。因此,本課題就Nrf2在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型以及膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝損傷模型中發(fā)揮的作用進行研究探討。第一部分Nrf2缺失使雌激素降低肝臟脂肪的作用增強目的Nrf2能夠調(diào)控包括肝臟脂類代謝在內(nèi)的多種生物進程。雌激素能夠發(fā)揮能量調(diào)節(jié)的作用如肝臟的降脂作用。越來越多的證據(jù)顯示這兩種因子之間有相互交聯(lián)的關(guān)系。然而Nrf2和雌激素能否通過相互作用來調(diào)節(jié)肝臟的脂肪代謝,目前尚未見報道。因此本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝模型,來觀察Nrf2信號通路是否能夠調(diào)節(jié)雌激素在肝臟脂肪代謝中發(fā)揮的作用。方法1.高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立和分組處理雄性Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠各25只,分別將其隨機分成普通飲食飼養(yǎng)組,高脂飲食飼養(yǎng)組。高脂飲食飼養(yǎng)組再分為溶劑對照組,雌二醇(estradiol, E2)組,黃體酮(progesterone, P)組,以及雌二醇和黃體酮混合組。高脂飲食組給予高脂飲食(HFD)飼養(yǎng),16周后,分別腹腔注射溶媒,E2,P以及E2+P,每天一次,連續(xù)三周,同時繼續(xù)給予高脂飲食飼養(yǎng)。三周后處死動物,解剖獲取動物的肝組織,稱重,計算肝重比。隨后進行肝組織蘇木精-伊紅(HE)染色和油紅脂滴染色。2.免疫組化SP法檢測FABP5和TFF3蛋白的表達采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù),S-P法免疫組織化學染色,用DAB/H2O2顯色,蘇木精復(fù)染檢測脂肪酸結(jié)合蛋白-5(Fatty acid binding protein 5, FABP5)、三葉肽因子-3(Trefoil factor family 3, TFF3)蛋白的表達。用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。3.肝組織中脂質(zhì)含量的檢測采用試劑盒檢測肝臟中的甘油三酯,總膽固醇以及游離脂肪酸的含量,具體操作遵循試劑盒說明書。4.實時熒光定量RT-PCR法對mRNA的水平進行檢測TaqMan通用的PCR混合液和探針,以及小鼠Nrf2 (Mm00477786_ml), NQO1 (MmO1253561_ml), ERa(Mm00433149_ml), ERβ(Mm00599821_ml), TFF3 (Mm00495590_ml), FABP5 (Mm00783731_s1),以及albumin (Mm00802090_m1)探針均購于Applied Biosystems (Foster City, CA)。擴增反應(yīng)在ABI Prism 7900序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA)中進行。5. Western blot法檢測肝組織中NQO1,ERa,FABP5蛋白的表達提取肝組織中的總蛋白,Western blot法進行組織化學染色,用ECL進行顯色,檢測肝組織中NQO1,ERa,FABP5蛋白的表達。結(jié)果1.Nrf2的缺失使雌激素在非酒精性脂肪肝中降低肝臟脂肪的作用得到增強19周后處死動物,獲取肝組織,我們發(fā)現(xiàn)與普通飲食飼養(yǎng)的小鼠比較,高脂飲食誘導(dǎo)的兩種基因型小鼠在溶劑對照組中,肝臟增大,有大量的脂肪堆積。與溶劑對照組相比,給予外源的雌激素會導(dǎo)致兩種基因型的小鼠肝臟體積縮小,脂肪堆積減少,發(fā)揮降低脂肪肝的作用。組織學的評估顯示當Nrf2缺失時,雌激素的降脂效果顯著增強。為了更進一步證明以上發(fā)現(xiàn),我們對肝組織進行油紅染色觀察肝組織中脂肪堆積情況。結(jié)果顯示,與溶劑對照組比較,雌激素治療降低了野生型小鼠肝臟中脂肪的含量,值得注意的是,雌激素的治療幾乎使Nrf2缺失小鼠肝臟中的脂肪完全消失。2.Nrf2缺失同時給予雌激素治療使非酒精性脂肪肝組織中TFF3和FABP5蛋白的表達增強在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝中,給予外源的雌激素可以增加兩種基因型小鼠肝臟中TFF3和FABP5蛋白的表達。當Nrf2缺失同時給予雌激素治療時,TFF3和FABP5蛋白的表達相較于野生型小鼠顯著增強。3.Nrf2缺失同時給予雌激素治療使非酒精性脂肪肝組織中甘油三脂,膽固醇,游離脂肪酸含量降低相較于普通飲食組小鼠,高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠,肝組織中的甘油三酯,總膽固醇和游離脂肪酸過度堆積。在野生型小鼠中,相對與溶劑對照組,給予外源的雌激素降低了肝臟中的甘油三酯,游離脂肪酸的含量,而對總膽固醇沒有顯著的影響。當Nrf2缺失時,相對于溶劑對照組,外源的的雌激素顯著的降低了肝臟中甘油三酯,游離脂肪酸和總膽固醇的含量。4.Nrf2缺失同時給予雌激素治療能夠提高非酒精性脂肪肝組織中的TFF3mRNA水平實時定量RT-PCR結(jié)果顯示,在野生型小鼠中,相比較于普通喂養(yǎng)的小鼠,高脂飲食喂養(yǎng)使Nrf2激活,并上調(diào)了Nrf2和NQO1基因的表達。雌激素治療組對Nrf2沒有顯著的影響,對NQO1的轉(zhuǎn)錄水平有略微的提高。普通喂養(yǎng)的小鼠中,Nrf2的缺失導(dǎo)致ERα mRNA, TFF3 mRNA的表達增強。與普通喂養(yǎng)的小鼠比較,高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠肝臟ERα mRNA的表達水平提高,而Nrf2缺失的小鼠ERα mRNA的表達水平降低。值得注意的是,雌激素治療的野生型小鼠肝組織中TFF3 mRNA的表達有所提高,而Nrf2缺失同時給予雌激素治療的小鼠肝組織中TFF3 mRNA的表達有著更為顯著的提高。結(jié)論1.Nrf2在肝臟脂肪代謝過程中與雌激素信號通路起到對抗的作用。2.肝臟中FABP5的表達水平與雌激素降低脂肪肝的作用呈正相關(guān),Nrf2能夠抑制外源雌激素治療的肝臟中FABP5的表達。第二部分 Nrf2缺失在膽汁淤積癥中使肝實質(zhì)細胞的類肝樣細胞CD133+表達增強目的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細胞防御系統(tǒng)對抗氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)生的中心調(diào)控因子,它同時也涉及疾病誘導(dǎo)的肝損傷引起的肝臟再生。CD133被廣泛的作為肝臟前體細胞標記物,然而Nrf2信號通路是否參與修復(fù)膽汁淤積性的肝臟損傷并調(diào)節(jié)CD133的表達目前尚不清楚。因此本研究采用BDL誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷模型對Nrf2信號通路能否調(diào)控肝臟的修復(fù)功能,是否與肝臟前體細胞相關(guān)進行探討。方法1. 膽汁淤積性肝損傷模型的建立和分組處理雄性Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠各50只,分別將其隨機分成對照組,BDL組。整個飼養(yǎng)周期采用標準飲食飲水。在無菌環(huán)境中對小鼠進行膽總管結(jié)扎手術(shù)和假手術(shù)。采用吸入性麻醉劑對小鼠進行麻醉,將膽總管暴露,間隔2毫米,用兩根線,對膽總管進行結(jié)扎,將兩根線之間的膽總管切開。對照組的小鼠進行假手術(shù),將膽總管暴露,但不進行結(jié)扎。分別在手術(shù)后的不同時間點處死小鼠,獲取肝臟,稱重,計算肝重比。2. 免疫組化SP法檢測Ki67,Laminin,CK19,CD133蛋白的表達采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù),S-P法免疫組織化學染色,用DAB/H2O2顯色,蘇木精復(fù)染檢測Ki67,Laminin,CK19,CD 133蛋白的表達。用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。3. Western blot法檢測肝組織中NQO1,CD133,CK19蛋白的表達提取肝組織中的總蛋白,Western blot法進行組織化學染色,用ECL進行顯色,檢測肝組織中NQO1,CD133,CK19蛋白的表達。結(jié)果1.Nrf2的缺失不會導(dǎo)致膽總管結(jié)扎后肝臟損傷加強Nrf2的缺失不能夠影響膽總管結(jié)扎所誘導(dǎo)的肝臟體積的變化,肝細胞的增殖,以及肝臟纖維化的水平。2.Nrf2在膽汁淤積癥的發(fā)展過程中被持續(xù)激活NQO1是一個典型的Nrf2靶基因,有研究顯示在膽管結(jié)扎所誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷中,NQO1僅僅受到Nrf2的調(diào)控。我們的研究發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝臟中NQO1蛋白的表達隨著膽汁淤積癥的發(fā)展逐漸增強,當Nrf2缺失時,NQO1蛋白的表達完全被阻止。這個發(fā)現(xiàn)顯示在膽汁淤積癥中,肝臟Nrf2具有持久和強大的活化作用。3.Nrf2的缺失導(dǎo)致類肝樣細胞內(nèi)CD 1 33+表達增強免疫組化以及Western blot結(jié)果均顯示,Nrf2基因的缺失會導(dǎo)致類肝樣細胞CD133的陽性表達顯著增強,揭示了Nrf2是肝臟前體細胞一個至關(guān)重要的調(diào)控因子。結(jié)論1.Nrf2的缺失不會導(dǎo)致膽總管結(jié)扎后肝臟損傷加強。2.在膽汁淤積癥的發(fā)生發(fā)展過程中,Nrf2具有持續(xù)活化的作用。3.Nrf2的缺失導(dǎo)致類肝樣細胞內(nèi)CD133+表達增強,表明Nrf2是肝臟前體細胞一個至關(guān)重要的調(diào)控因子。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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本文編號：1243167